Исследование реакционной способности и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к соединениям ртути (II), страница 29

Определение констант устойчивости гуматов ртути(II)3.2.7.1. Обоснование выбора буферного раствораПри определении констант устойчивости гуматов ртути отдельнуюпроблему представляло собой поддержание нейтрального рН растворов,характерного для природных водных сред. В этих целях нельзя использоватьбольшинствостандартныхбуферныхрастворов(например,гидро-дигидрофосфатный буфер), поскольку их компоненты образуют с Hg(II) прочныесоединения [47].

Поэтому в качестве буферной среды был выбран углекислотногидрокарбонатный буфер, так как именно углекислотно-гидрокарбонатнаябуферная система определяет рН большинства природных вод, следовательноиспользование такой буферной среды создает условия, приближенные кприродным. Однако данный буферный раствор обладает большим недостатком:из-за выделения CO2 он способен поддерживать рН, только будучи сильноразбавленным.Указанный буферный раствор, создавали введением 0.0025М NaHCO3 и0.0004 М HNO3.Полученный буфер добавляли к исследуемым растворам израсчета 2 мл буфера на 10 мл итогового раствора.

Как показали эксперименты, за4 часа рН исследуемых растворов поднимался не более, чем на 0.3 (с 6.9 до 7.2).3.2.7.2. Ионообменный методКонстантыустойчивостигуматовртутиопределяли для трех препаратов - Т4, МН4, МТ4.ионообменнымметодом173При определении констант устойчивости гуматов ртути ионообменнымметодом все растворы содержали 0.01М KCl. Последний вводили для переводавсей Hg(II), не связанной с ГФК, в форму HgCl2.Для определения коэффициента распределения Hg(II) между катионитом ираствором в отсутствие ГФК в мерных колбах на 25 мл готовили растворыHg(NO3)2 с концентрацией 100, 200, 600 и 800 нМ.

Растворы помещали встеклянныепузырьки(входепредварительныхэкспериментовбылоустановлено, что в присутствии KCl Hg(II) практически не сорбируется настекле), к ним добавляли по 200 мг катионита в Na-форме и перемешивали втечение часа. По окончании перемешивания в растворе над катионитомопределяли концентрацию Hg(II) и на основании полученных данныхрассчитывали коэффициент распределения.Для определения коэффициента распределения Hg(II) в присутствии ГФКдля каждого препарата готовили серию растворов, содержащих 800 нМ Hg(NO3)2и ГФК в концентрациях 2, 5, 10, 15, 25, 40 мг/л. Как и в предыдущем случае, крастворам добавляли 200 мг катионита, перемешивали в течение 1 часа иопределяли концентрацию Hg(II) над катионитом.3.2.7.3. Адсорбционный методДля определения констант устойчивости комплексов ртути(II) с ГФКполучали изотермы сорбции ртути(II) на полиэтилене в присутствии и вотсутствие ГФК.

Концентрации ГФК составляли 2, 10 и 40 мг/л, концентрацииHg(II) - 50, 100, 150, 200 и 250 нМ. Для получения изотерм адсорбции вполиэтиленовые сцинтилляционные пузырьки объемом 20 мл помещалиHg(NO3)2 определенной концентрации, раствор ГФК (рН предварительнодоводили до 7) и 2 мл 0.0025М углекислотно-гидрокарбонатного буфера. Объемраствора доводили до 10 мл. Пузырьки закрывали и перемешивали содержимое втечение четырех часов. По истечении указанного времени концентрацию ртути врастворе определяли в соответствии с методикой, описанной в разд.

3.2.4.Количество Hg(II), адсорбировавшейся на стенках, определяли, смывая еесоляной кислотой. Для этого пузырьки заливали 10 мл 0.5 М HCl иперемешивали 3 часа, после чего определяли ртуть в смыве. На основании174полученных данных рассчитывали количество адсорбированной ртути. Полнотаобнаружения ртути по результатам двух определений - в растворе и в смыве состенок - всегда колебалась около 100%. Это говорит как о полном обнаруженииртути в растворе, содержащем ГФК, так и о полной десорбции Hg(II) сполиэтилена под действием 0.5 M HCl. На основании данных по распределениюHg(II) между раствором и стенками сосуда строили изотермы адсорбции.3.2.8. Получение соединений Hg(II) с модельными органическимикислотами.Приготовлениенатриевыхсолеймодельныхкислот.Дляприготовления натриевых солей модельных кислот к 2 М спиртовому растворуNaOH добавляли спиртовой раствор соответствующей кислоты.

Соотношенияреагентов (Табл. 3.7) подбирали таким образом, чтобы NaOH находился внебольшом избытке. Выпавший осадок фильтровали, промывали спиртом, затемэфиром и сушили сначала на водоструйном насосе, а затем - над P2O5. Выходсоставлял 90-96% от теоретического (по кислоте).Таблица 3.7Соотношения реагентов для получения натриевых солеймодельных кислотКислотаМассаОбъем спирта длякислоты, г растворения кислоты,млАдипиновая3.6402,4-дигидроксибензойная3.850Фталевая4.150Янтарная3.050Объем 2 МспиртовогоNaOH, мл27142728Приготовление ртутных солей модельных кислот.

Для приготовленияртутных солей модельных кислот к 0.27 М водному раствору Hg(NO3)2 (рНкоторого предварительно доводили до 1.5 раствором NaOH) добавляли водныерастворы натриевых солей соответствующих кислот. Соотношения реагентовприведены в Табл. 3.8.175Таблица 3.8Соотношения реагентов для получения ртутных солей модельныхкислотКислотаАдипиновая2,4-дигидроксибензойнаяФталеваяЯнтарнаяМасса Naсоли, г2.92.73.22.5Объем воды длярастворения соли, мл40404040Объем 0.27 МHg(NO3)2, мл20202020Выпавшие осадки отфильтровывали, промывали спиртом, затем - эфиром,сушили на водоструйном насосе, затем - над P2O5.3.2.9.

Методики альгологического биотестирования3.2.9.1. Культивирование водорослиДляпроведенияальгологическогобиотестированияиспользоваликультуру зеленой водоросли Chlorella Pyrenoidosa.Культивированиеинтенсивнойкультурыхлореллы(термофильныйштамм) осуществляли на 20%-ной среде Тамия (Табл.

3.1) в термостатируемыхкультиваторах емкостью 200 мл, при температуре 35°С, с продувкойувлажненным воздухом, при освещенности 800 лк (люминесцентные лампы типаЛДЦ-40). Перед тестированием водоросли разращивали в течение двух суток. Кконцу разращивания плотность клеток составляла около 20 млн. кл./мл.Интенсивную культуру хлореллы после двухсуточного выращиванияосвобождали от культуральной среды и концентрировали центрифугированием втечение 3-х минут при 5000 об/мин. Сконцентрированную суспензию водорослейпересеивали в среду для биотестирования.3.2.9.2. Измерение фотосинтетической активности водорослиДля оценки состояния водорослей использовали параметры быстройфлуоресценции. В качестве тест-функции использовали относительный выходпеременной флуоресценции R=Fv/Fm, характеризующий квантовую эффективность первичной фотосинтетической реакции.

Величина Fv (переменная флуоресценция) определяется как разность Fv=Fm-Fo. При этом величина Fm (максималь-176ная флуоресценция) отражает полное количество поглощенной световой энергии, а величина Fo (постоянная флуоресценция) - излучательные потери поглощенной световой энергии возбуждения при миграции ее к открытымреакционным центрам и обычно пропорциональна концентрации хлорофилла.У лабораторной культуры хлореллы в оптимальных условиях Fv/Fmсоставляла 0.5 - 0.55. При нарушениях этот параметр уменьшается.

У мертвыхклеток Fv/Fm=0.ДляпроведениятоксикологическихэкспериментовсHg(II)вкультиваторы помещали 50 мл тест-среды (см. ниже), добавляли водоросль (втаком количестве, чтобы начальная плотность культуры составляла 2 млн. кл./мл.(0.3 мг/л хлорофилла А) и включали продувку увлажненным воздухом.Остальные условия альгологического тестирования (освещенность, температура)были теми же, что и при выращивании культуры. Через 4 часа после добавленияводоросливтест-раствор измеряливыходпеременнойфлуоресценции.Измерение проводили следующим образом. При освещении адаптированных ктемноте клеток водорослей синим светом измеряли интенсивность постояннойфлуоресценции (Fо).

Интенсивность максимальной флуоресценции (Fm) привосстановленном первичном хинонном акцепторе измеряли аналогичнымобразом в присутствии 10-5 М диурона. Относительный выход переменнойфлуоресценции рассчитывали по формулеR=(Fm-Fо)/Fm( 3.2)Как показали измерения R для одной и той же культуры хлореллы,относительная ошибка метода составляет 5%. Если измерения проводить дляразличных культур, эта величина увеличивается до 10%.3.2.9.3. Приготовление тест-растворов, содержащих Hg(II)УстановлениедиапазонатоксичностиHg(OH)2.Готовилибесхлоридную среду для биотестирования - раствор, содержащий 5 мМ KNO3 и 1мМ MgSO4.

Его рН доводили до 7.2 гидроксидом натрия. После этого в серию из11 мерных колб на 50 мл помещали 10-4М раствор Hg(NO3)2, приготовленныйразбавлением 10-2 М раствора в среде для биотестирования с последующимдоведением рН до 5 гидроксидом натрия. Объемы 10-4М растворов Hg(NO3)2177подбирали таким образом, чтобы итоговая концентрация Hg(II) в разных тестрастворах составляла от 1 до 20 мкМ. После добавления Hg(NO3)2 в мерныеколбы наливали до метки среду для биотестирования и полученные растворыиспользовали в качестве тест-растворов.Установление диапазона токсичности HgCl2. Готовили хлориднуюсреду для биотестирования - раствор, содержащий 10 мМ KCl, 5 мМ KNO3 и1 мМ MgSO4. Его рН доводили до 7.0 или 6.4 гидрокарбонатом натрия.

Послеэтого в серию из 12 мерных колб на 50 мл помещали 10-4М раствор Hg(NO3)2,приготовленный разбавлением 10-2 М раствора в хлоридной среде длябиотестирования с последующим доведением рН до 5 гидроксидом натрия.Объемы 10-4 М растворов Hg(NO3)2 подбирали таким образом, чтобы итоговаяконцентрация Hg(II) составляла 0.1-6 мкМ. Для приготовления наиболееразбавленных растворов использовали 10-5М Hg(NO3)2. После добавленияHg(NO3)2 в мерные колбы растворы доводили до метки хлоридной средой длябиотестирования и использовали их в качестве тест-растворов.Исследование влияния ГФК на фотосинтетическую активность водорослей.

В серию мерных колб на 50 мл помещали растворы ГФК с таким расчетом, чтобы концентрации ГФК в тест-растворах составляли 10 и 40 мг/л. Растворы ГФК доводили до 50 мл хлоридной средой для биотестирования и использовали их в качестве тест-растворов. Были исследованы следующие препаратыГФК: Т4, Т6, МТ4, МИ13, МН4, МХ7, МХ11, МХ14, бв1, ДПл(Н), МИ12, АГК.Исследование влияния ГФК на токсичность Hg(OH)2. Готовили двесерии растворов с различной концентрацией Hg(II) (4 и 16 мМ).