Диссертация (Когерентные взаимодействия сверхкоротких импульсов ближнего и среднего инфракрасного диапазонов в задачах микроспектроскопии и дистанционного зондирования), страница 5

Резонансный сигнал связан свозбуждением колебательных движений ядер в молекуле и синхронизацией этихколебаний среди ансамбля молекул в возбуждаемом накачкой объеме вещества.Генерирующийся резонансный сигнал резко возрастает, когда разность частот волннакачки и стокса ωp – ωs совпадает с частотой комбинационно-активного перехода ввеществе. Микроскопия КАРС обладает всеми преимуществами нелинейнооптических техник формирования трехмерного микроскопического изображения иможет быть реализована на длинах волн излучения, попадающих в окна прозрачностивыбранного объекта исследования. Как было отмечено ранее, главное достоинстводаннойметодикизаключаетсяввозможностихимическиизбирательнойбезмаркерной микроскопии объектов, что позволяет визуализировать распределениелипидов, различных белков, молекул ДНК/РНК в тканях живых животных [39,71–74],и находит свое применение для обнаружении раковых опухолей микроскопическихразмеров [71], диагностике и исследовании причин атеросклероза [75].

Особуюраспространенность методика КАРС-микроскопии нашла в задачах безмаркернойвизуализации различных видов липидов, представляющие большую важность дляживого организма (рис.1.1.3.б) [76–78].Нелинейно-оптический процесс четырехволнового взаимодействия (ЧВВ) ωas =(ωp – ωs) + ωpr, упомянутый при описании методики КАРС, находит применение воптической спектроскопии и при отсутствии низкочастотных колебательныхрезонансов.

Спектроскопическая информация может быть получена, когда волнынакачки ωp, пробного излучения ωpr или их комбинация ωp + ωpr попадают в областьэлектронных резонансов вещества, что отражается в усилении сигнала (рис.1.1.1.в).Таким образом можно увеличить ЧВВ сигнал от наноразмерных структур нанесколькопорядков,чтопозволяетвизуализироватьодиночныезолотыенаностержни, нанопровода и одностеночные углеродные нанотрубки [12,40,79,80].Методикамикроскопиивынужденногокомбинационного(рамановского)рассеяния (ВКР) света близка по своей природе к нелинейной микроскопии КАРС, итакже базируется на визуализации комбинационных резонансов молекул вещества- 22 (рис.1.1.1.б).

Впервые процесс ВКР наблюдался в экспериментах Е.Дж.Вудбери иВ.К.Нг в 1962 году [81], а спектроскопическая методика была реализована сиспользованием двух непрерывных лазеров в 1977 году [82]. Первые демонстрацииновой методики многофотонной микроскопии на основе ВКР были произведенытолько в 2008 и 2009 годах [43,44], что связано с высокой технической сложностью еереализации. Спектроскопическая информация извлекается при записи усилениястоксовой волны в поле накачки, когда разность частот возбуждающих импульсов ωp– ωs попадает в комбинационный резонанс ΩR.

Преимущества спектроскопии ВКРусиления над процессом КАРС заключаются в том, что методика полностью свободнаот нерезонансного фона, а спектральный профиль повторяет спектр линийспонтанного комбинационной рассеяния. В условиях, соответствующих проведениюВКР микроскопии, изменение мощности стоксовой волны крайне мало (ΔP/P < 10-4)[43], что принципиально усложняет задачу реализации оптической сканирующеймикроскопии. Тем не менее, эта задача все же была решена для микровизуализациимедикаментов и живых клеток (рис.1.1.3.в) [43,74,83].(а)(б)(в)Рис.1.1.3.

(а) Одно из первых изображений распределения липидных тел в клеткеHeLa, полученное при помощи КАРС-микроскопии, частоты излучений накачекнастроены на резонанс колебаний группы CH [69]. (б) КАРС-микроскопиямиелиновых оболочек нервных волокон в спинном мозге крысы [78]. (в) Составноемикроизображение клетки дрозофилы, полученное при помощи ВКР-микроскопии.Зеленым отмечены области богатые липидами (2845 см-1), голубым – белками,ненасыщенными жирами (линия Amide I 1655 см-1), розовым и фиолетовым – областибогатые нуклеиновыми кислотами (785 см-1 и 1090 см-1, соответственно), размерклетки около 25 мкм [74].- 23 Для реализации нелинейно-оптических методик на основе процессов генерацииоптических гармоник необходим только один лазерный источник и не требуютсямаркировки объекта, что делает их удобными кандидатами в качестве независимыхилидополняющихметодиквизуализациивужереализованныхсистемахмикроскопии КАРС или ДФП [13].

Процесс удвоения частоты падающего излучения(рис.1.1.1.г) впервые наблюдался при фокусировке импульсов рубинового лазера вкристаллический кварц в 1961 году [84]. Использование данного процесса длялазерной микроскопии было предложено еще в 1978 году в работе К.Дж.Шепарда[85], затем этот метод был развит этой же группой в 1998 году с использованиемисточников сверхкоротких импульсов [86].

Данный нелинейный процесс возможентолько в средах не обладающих центром инверсии, поэтому микроскопия ГВГчувствительна к зондированию упорядоченных структур, таких как ориентированныемассивы биомолекул, белковые кристаллы, коллагены (рис.1.1.4.б) [46,87,88].Использование специальных красителей, молекулы которых обладают высокойквадратичной гиперполяризуемостью и встраиваются в мембраны нервных клетокмозга, дает возможность с помощью ГВГ-микроскопии проводить оптическоеисследование активности нейронов, в частности, распространение потенциаладействия по нейронной сети [87,89]. Для целей визуализации клеток in vivo такжеможет быть использована эффективная генерация второй гармоники от наночастиц[90–92].Нелинейно-оптический процесс генерации третьей гармоники (ГТГ) (рис.1.1.1.д)не запрещен в изотропных средах, но сильно подавлен в случае жесткой фокусировкив однородную среду с нормальной дисперсией, что связано с включением в условиефазовогосогласованиядополнительногогеометрическогонабегафазыГои,приводящего к деструктивной интерференции сигнала на утроенной частоте до ипосле фокальной плоскости [93].

Данная особенность этого параметрическогопроцесса используется в микроскопии ГТГ для визуализации оптических инелинейно-оптическихнеоднородностейисследуемойткани,приводящихкнарушению баланса деструктивной интерференции и появлению ненулевого сигналана утроенной частоте излучения накачки.

Впервые данный подход для проведенияоптической микроскопии был реализован в работах Я.Силберберга в конце 90-ыхгодов прошлого века (рис.1.1.4.а) [48,49]. ГТГ-микроскопия находит широкое- 24 применение для визуализации интерфейсов между тканями, клеточных мембран,различных выемок и неоднородностей, а также позволяет восстанавливатьтрехмерную морфологию толстых биологических образцов (рис.1.1.4.в) [49–51,94].Генерация третьей гармоники особенно эффективно может происходить отнаночастицзасчетповерхностныхплазмонов,чтопредлагаетещеодиндополнительный вариант зондирования таких биомаркеров [95,96].(а)(б)(в)Рис.1.1.4. (а) Одно из первых изображений биологического объекта (нейрон вкультуре клеток), записанное методом микроскопии ГТГ, размер клетки 15 мкм [49](б) Изображение сетчатой структуры легких, построенное при помощимикроскопии ГВГ (зеленые области: коллаген) и ДФП (красные: эластин, макрофаги),показывающее распределение макрофагов, масштабная отметка 100 мкм [88].

(в)Комбинированное изображение на основе микроскопии ГТГ (красные области:липиды в межклеточном пространстве) и ДФП (зеленые: тела клеток) среза тканимозга мыши [51].Совершенно уникальную возможность проводить оптическую микроскопию спространственным разрешением в несколько раз превосходящим дифракционныйпредел (например, одно из рекордных значений составляет 6 нм для визуализациицентров окраски в кристаллах [62]) представляет методика флуоресцентноймикроскопии с подавлением спонтанного излучения света (Stimulated EmissionDepletion Fluorescence Microscopy (STED)) (рис.1.1.1.к). Теоретическое предсказаниеиэкспериментальнаяреализацияновогоподходаоптическоймикроскопиисверхвысокого разрешения было представлено Ш.Хеллем в 1994 году [60].

Основнаяидея состоит в формировании в фокальной плоскости двух пучков на разных длинах- 25 волн и различной формы. Первое пятно излучения традиционной гауссовой формы надлине волны возбуждающей краситель, а излучение на большей длине волны,попадающей в полосу испускания красителя, имеет форму кольца с проваломинтенсивности в центре. В тех областях пространства, где пучки пересекаются,происходит снятие возбуждения молекул за счет процесса вынужденного усилениялазерного излучения второго пучка. Таким образом, остается только малая область вцентре кольца с флуоресцирующими молекулами, размер которой сильно зависит отинтенсивности зондирующего излучения, и может составлять всего несколькодесятков нанометров в поперечных координатах.

С помощью этой методикипродемонстрирована микроскопия сверхвысокого разрешения массивов различныхнаноразмерных объектов [61], центров окраски в кристаллах [62], отдельныхсинопсических пузырьков (везикул) (рис.1.1.5.а) [97].(а)(б)Рис.1.1.5. (а) Визуализация отдельных синопсических пузырьков (везикул) вдендритах нейрона при помощи флуоресцентной STED-микроскопии. Масштабнаяотметка 0.5 мкм, поперечное пространственное разрешение около 66 нм [97]. (б)Определение связей и взаимодействий молекул воды на границе раздела гидрофобнойжидкости (CCl4) и воды по спектрам сигнала спектроскопии ГСЧ с использованиемимпульсов среднего ИК диапазона [98].Все описанные выше методики нелинейно-оптической микроскопии реализуютсяна фемтосекундных или пикосекундных лазерных системах ближнего ИК диапазона.Использование излучения среднего ИК диапазона (3 – 15 мкм), которое попадает в- 26 область характерных частот колебательных переходов в молекулах, представляеттакже большой интерес, как для линейных, так и для нелинейных методикспектроскопии [99].

На сегодняшний день, наиболее развитая нелинейно-оптическаяметодика с использованием сверхкоротких импульсов длинноволнового диапазонаосновывается на процессе генерации суммарной частоты (ГСЧ) ωSFG = ωp + Ωmid-IR, награнице раздела исследуемого объекта (рис.1.1.1.е) [29,79]. Наличие резкой границыдвухсредобусловленоисследуемомобъеме,требованиемприводящееотсутствиякпоявлениюцентральнойсимметрииненулевойвквадратичнойвосприимчивости χ(2) ≠ 0.