Диссертация (Когерентные взаимодействия сверхкоротких импульсов ближнего и среднего инфракрасного диапазонов в задачах микроспектроскопии и дистанционного зондирования), страница 4

Когерентная и нелинейнаяприродамногофотонноймикроскопиитребуетналичиеэффективныхитехнологичных источников сверхкоротких импульсов, более того, управлениепараметрами лазерных импульсов позволяет добиваться улучшения ее спектрального,временного и пространственного разрешения, что описано в параграфе 1.2.Микроструктурированные (МС) световоды являются перспективными кандидатамидля спектрально-временных преобразований сверхкоротких импульсов и реализациина их основе источников накачки для нелинейно-оптической микроскопии, чемупосвящен параграф 1.3. В последнем параграфе 1.4 рассмотрен вопрос применениянелинейных когерентных методик с использованием коротких импульсов длярешения задач дистанционного зондирования. Актуальность темы очень высокапосле недавних демонстраций возможности удаленного формирования источниковлазерных импульсов на атомах кислорода и молекулах азота в атмосфере [20,22,23].- 17 §1.1 Нелинейно-оптические методы микроспектроскопии с использованиемсверхкоротких лазерных импульсовПрименение сверхкоротких лазерных импульсов для сканирующей оптическоймикроскопии привело к зарождению ряда новых методик оптической визуализацииобъектов в биологии и науках о материалах.

Развитие компактных и технологичныхквазинепрерывных источников фемтосекундных импульсов с высокой пиковоймощностью в ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне позволило реализоватьразличные методики неразрушающей микроскопии высокого пространственногоразрешения биологических объектов на базе хорошо известных нелинейнооптических процессов (рис.1.1.1). Высокая нелинейность процессов, используемых вмногофотонной микроскопии, накладывает серьезные требования на пиковыеинтенсивности используемого излучения, что требует наличия импульсов сосверхмалой длительностью при их относительно невысоких энергетическихпараметрах.

Более того, во многих задачах короткая длительность импульсовявляется дополнительным преимуществом, позволяющим избежать лавинногообразования электронов и фотоповреждения, характерных при работе с мощнымизлучением [34,35].По используемым нелинейно-оптическим процессам для зондирования объектасемействометодикмногофотонноймикроскопииможноразделитьнапараметрические и непараметрические. К первому типу относятся: микроскопиякогерентного антистоксова рассеяния света (КАРС) [36–39], четырехволновыевзаимодействия (ЧВВ) [12,40,41], вынужденное комбинационного рассеяния (ВКР)[42–45], генерации второй (ГВГ), третьей (ГТГ) оптических гармоник [46–51] исуммарной частоты (ГСЧ) [52–54], а также методики «накачка-зондирование» [55,56].Данныесхемыприводяткгенерациикогерентноголазерногоизлучения,интенсивность или спектр которого обладает интересующей информацией опараметрах вещества в исследуемом микрообъеме.

К непараметрическим методамотносится лазерная флуоресцентная микроскопия при двухфотонном (ДФП) итрехфотонном (ТФП) поглощении [57–59], микроскопия с подавлением спонтанногоизлучения света (Stimulated Emission Depletion (STED)) [60–62]. Здесь, как и в- 18 линейных методиках флуоресцентной микроскопии, свет переизлучается во всестороны с одинаковой интенсивностью, что удобно для регистрации сигнала вобратном направлении.

Каждая из перечисленных техник нелинейно-оптическогозондирования обладает специфичностью либо к различным молекулам вещества,либо к микро- или даже наноструктуре образца, что позволяет всестороннеисследовать такие сложные объекты, как биологические ткани. Далее мы рассмотримособенности этих методик, проанализируем, какую уникальную информацию можноизвлечь с их помощью.Рис.1.1.1. Энергетические диаграммы нелинейно-оптических процессов,находящие применения в многофотонной микроскопии. Расшифровка сокращенийприведена в тексте.Микроскопия ДФП впервые продемонстрирована в 1990 году в работе В.Денка[57] и представляется наиболее распространенной нелинейно-оптической методикой.Ее суть заключается в возбуждении специальных маркерных молекул красителя припоглощении двух фотонов накачки и последующем испускании одного фотоналюминесценции на более короткой длине волны, чем у падающей накачки- 19 (рис.1.1.1.жирис.1.1.2.а).НелинейнаяприродапроцессаДФПпозволяетформировать трехмерные изображения с высоким пространственным разрешениемпри жесткой фокусировке лазерного излучения, а также обуславливает малый объемвозбуждения, что значительно понижает фотоповреждение образца и помогаетрешить проблему фотовыцветания маркеров.

Использование импульсов накачкиближнего ИК диапазона имеющихся лазерных генераторов на кристаллах Ti:sapphireи Cr:forsterite (длины волн 0.8 и 1.25 мкм, соответственно) позволяет исследоватьглубокие слои сильно рассеивающих тканей. Большое разнообразие доступныхфлуоресцентных красителей, маркирующих множество биологических, химических иэлектрофизических процессов в клетках живых организмов, а также простотаметодики, объясняет широкое распространение микроскопии ДФП в биологии и, вчастности, в задачах нейрофизиологии [63–65].

Дальнейшее продвижение в ИКобласть спектра позволяет уменьшить рассеяние лазерного излучения накачкибиотканями и проникнуть глубже в исследуемый объект. Демонстрация микроскопиитрехфотонного поглощения (ТФП) с использованием мощных сверхкороткихимпульсов на длине волны 1.65 мкм позволила исследовать ткани мозга на глубине до1.4 мм (рис.1.1.1.з и рис.1.1.2.в) [59].(а)(б)(в)Рис.1.1.2. (а) Первое изображение клеток, полученное методикой ДФПмикроскопии, масштабная отметка - 10 мкм [57].

(б) Изображение пирамидальныхнейронов, окрашенных желтым флуоресцентным белком YFP (выделены зеленым), икровеносных сосудов, визуализированных с помощью маркера Texas Red (выделеныкрасным), полученное из ткани главного мозга живой анестезированной мыши спомощью микроскопии ДФП [58]. (в) Визуализация нейронов мыши с помощьюмикроскопии ТФП с глубины 0.85 мм от поверхности мозга [59].- 20 С другой стороны, активно развиваются безмаркерные подходы оптическойхимически-селективной визуализации биохимических процессов в живых тканях набазезондированияколебательныхкомбинационно-активных(рамановских)резонансов молекул.

Среди нелинейно-оптических методик, предоставляющих такуюспектроскопическую информацию, одной из самых распространенных являетсякогерентное антистоксово рассеяние света (КАРС). КАРС – это резонансный случайчетырехволнового нелинейно-оптического процесса, в котором взаимодействуютфотоны накачки ωp, стоксовой волны ωs и зондирующего излучения ωpr, такимобразом, чтобы генерировался сигнал в антистоксовой части спектра ωas = (ωp – ωs) +ωpr, когда разность частот ωp – ωs попадает в комбинационный резонанс молекулвещества ΩR (рис.1.1.1.а). Впервые данный нелинейный процесс наблюдался вэкспериментах П.Д.Мейкера и Р.В.Терхьюна в 1965 году при нелинейно-оптическомсмешении волн в различных средах [66].

Детальный обзор множества родственныхметодик спектроскопии когерентного комбинационного рассеяния света приведен вмонографиях С.А.Ахманова, Н.И.Коротеева [1] и Г.Л.Изли [67]. Первая работа поКАРС-микроскопии с пикосекундными импульсами была продемонстрированаМ.Дунканом еще в 1982 году [68], но она не привела к бурному развитию этойобласти нелинейной микроскопии. Следующий важный шаг был сделан только вконце 90-ых годов XX века. Пионерские работы в направлении интеграции процессаКАРС с лазерной микроскопией были проведены в Гарвардском университете подруководством С.Ши. Данной группой проведены впечатляющие исследованияметодики КАРС-микроскопии, демонстрирующие ее потенциал для проведенияхимически-селективной визуализации биологических объектов с субмикроннымпространственным разрешением (рис.1.1.3.а) [36,38,69,70].Сигнал КАРС генерируется за счет неупругого рассеяния зондирующегоизлучения на наведенной импульсами накачки и стокса когерентности междуосновным и исследуемым колебательным уровнем (рис.1.1.1.а).

Отвечающая запроцесс КАРС кубическая нелинейно-оптическая восприимчивость χ(3) состоит изнедиспергирующей нерезонансной части χ(3)nr и резонансной χ(3)r = χ(3)r (ωp – ωs)компоненты, сильно зависящей от разности частот накачки и стокса ωp – ωs; при этомкаждая из частей дает свой вклад в формировании полного сигнала антистоксоварассеяния света. Физическая природа нерезонансного сигнала КАРС состоит в- 21 нелинейно-оптическом взаимодействии света с электронами, располагающимися навнутренних орбиталях атомов вещества, которые почти мгновенно отвечают навоздействие внешнего электромагнитного поля.