Создание наноструктурных систем для транспорта лекарственных препаратов на основе смеси тритерпеноидов бересты, страница 17

Изучение влияния на антигемолитические свойства каждого из входящихв препарат липидов показало, что действующим началом является цереброзид сульфат.Кроме того, дальнейшие исследования на модельных системах показали, чтофармакофором является гидрофобный скелет с двумя отрицательными зарядами нарасстоянии приблизительно 1,4нм.

Совместно с лабораторией протеолитических ферментовИнститута биоогранической химии РАН с помощью молекулярного докинга был локализовансайт связывания дизаряженных субстанций на С1q-компоненте комплемента . Изучение влияния на антигемолитические свойства каждого из входящих в препарат липидов такжепоказало, что действующим началом является цереброзид сульфат [190].Считается,чтоэффективностьлипосомныхпрепаратовможетсущественноувеличиться, если «нацеливать» их на клетки-мишени, присоединяя к липосомам«молекулярный адрес», т.е. молекулы, способные специфически связываться с клеткамимишенями. Для того, чтобы этот эффект мог проявиться, необходимо создать условия длядлительной циркуляции в крови, другими словами, следует использовать стерическистабилизированные липосомы.

Очевидно, что «молекулярный адрес» необходимо такжезакреплять на конце молекулы ПЭГ, чтобы он мог беспрепятственно взаимодействовать ссоответствующим рецептором . С этим направлением, в сотрудничестве с академиком РАМНВ.П. Чехонином, мы сконструировалилипосомы,загруженные доксорубицином противградиента сульфата аммония, на поверхности которых экспонированы цени ПЭГ-2000 иантитела к глиофибриллярному кислому белку [191]. Данный «молекулярный адрес» выбранне случайно - в качестве векторов для направленного транспорта лекарственных препаратов вочаги нарушения гематоэнцефалического барьера, на наш взгляд, необходимо использоватьнейроспецифические антитела (например, к основному белку миелина, глиофибриллярномубелку, нейроспецифической енолазе и др.).

Полученный препарат ПЭГилированных86иммунолипосом специфически связывался с антителами эмбриональных астроцитов мозгакрысы. В настоящее время ведутся исследования направленного транспорта другихантрациклиновых антибиотиков, интерлейкинов, ростовых факторов, генно-инженерныхпрепаратов (плазмиды, ДНК-вакцины, антисмысловые нуклеотиды, малые интерферирующиеРНК) с помощью иммунолипосом [191].Также в сотрудничестве с лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ имениакадемиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, мы тоже сконструировали липосомы,загруженные доксорубицином против градиента сульфата аммония, на поверхности которыхэкспонированы цепи ПЭГ-2000 и барстар на конце цепи ПЭГ-3500. Эта конструкцияпозволяет присоединять генно-инженерные химерные белки на основе барназы, котораяобразует прочный комплекс с барстаром (KF = 1014). Таким образом, с помощью генноинженерного конструктора, созданного в лаборатории проф.

С. М. Деева, на поверхностилипосом может быть экспонирован и флуоресцирующий белок, и миниантитела (например,против рецептора HER2-neu), и электронно-плотная метка и т.п. На рис. 62 представленаэлектронная микрофотография липосомы, полученной по разработанной технологии. Длявыявлениямолекулбарстаралипосомыинкубировалиснаночастицамизолота,конъюгированными с барназой [192].Рис. 62.Электронная микрофотография липосомы с присоединенными мишенями (в качестве мишеней -частицы коллоидного золота, связанные с барназой).В настоящее время у нас имеется набор липосом, включающий термочувствительные,стерически стабилизированные для увеличения времени циркуляции в крови, нацеливаемые спомощью молекулярного адреса" в определенный очаг патологии, жесткие нетекущие идругие.

Конечно, продолжение исследования и разработки новых наноструктур еще являетсянашей первостепенной исследовательской целей. В недавнем времени, в сотрудничестве снесколькимиисследовательскимибазами, мы87началирассматриватьиисследоватьконструкции на основе липосомы для направленной доставки генетического материала(основа генной терапии). Направленность доставки обеспечивает "молекулярный адрес",присоединенный к поверхности липосомальной частицы через гибкую полиэтиленгликолевуюцепочку, при этом ее длина больше длины подобных "пустых" цепочек, такжеприсоединенных к липосоме для увеличения времени циркуляции. В мембрану встроенымолекулы белка слияния для облегчения входа терапевтического гена в цитозоль. ДНК длякомпактизации и компенсации отрицательного заряда вводится в комплексе с положительнозаряженными фосфолипидами и полимерами.

Легко видеть, что приведенная конструкциянапоминает схему оболочки вируса - эффективной машины для введения чужеродной ДНК вклетку.С полученными результатами, мы создали прочную основу для дальнейшего развитиятакого перспективного исследовательского лекарственного транспортного направления . Внастоящее время и в будущий, продолжаемое совершенствование биологических испытаний сполученными нанопрепаратами, а также создание новых наноструктур еще являетсястратегической ориентацией в нашим плане.

И так, в дальнейшем работы по созданиюлипосомальных форм классических лекарственных препаратов (ЛП) активно продолжаются.Следует упомянуть следующие завершенные исследования этом направлении: ЛП "Липосан"наосновеяичногопротивоопухолевыйфосфатидилхолинаантибиотикдлягелиомицин,лечениягеморрагическогопротивоинсультныйпрепаратшока,семакс,цефтриаксон - препарат для лечения заживления ран, офтальмологический препаратдексаметазон, гонадотропин-препарат для стимуляции стероидогенеза, водорастворимыететрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака, десферал противохламидийныйпрепарат,карбамазепин-препаратдлялеченияэпилепсии,кардиологический препарат - цитохром С, антибактериальный препарат - хлорофилипт [190].Уже отмечалось, что важным преимуществом использования липосом являетсягибкость технологий их создания, позволяющая варьировать свойства носителей ЛП взависимости от характера и локализация очага патологии.

Для липосомальных ЛП характерныследующие положительные показатели: увеличение концентрации ЛП в крови; уменьшениеего токсичности; пассивное нацеливание ЛП в опухоль; пролонгирование его действия изащита от биотрансформация. Для увеличения времени циркуляции в крови используютлипосомы с привитыми полиэтиленгликолевыми цепями, так называемые стелс-липосомы.Дальнейшим развитием направления в плане создания активного транспорта липосом по88адресу патологических нарушений является использование иммуно-липосом и другихадресных конструкций [190].Туберкулез является инфекционным заболеванием, вызываемым микобактериямитуберкулеза, которые попадают в организм человека воздушно-капельным путем.

Более третинаселения земного шара являются носителями данной инфекции, и около 2 млн. человекежегодно умирает из-за этой болезни. При попадании в организм М. tuberculosis проникает вмакрофаги хозяина в составе фагосом и размножается в них благодаря своей способностипредотвращать слияние фагосом с лизосомами.

В настоящее время для лечения туберкулезаиспользуется достаточно эффективная схема терапии несколькими противотуберкулезнымипрепаратами первого ряда, включая рифампицин и изониазид. Однако, как выяснилось, ониоказывают выраженные побочные эффекты: рифампицин вызывает гепатит, изониазидвызывает психические расстройства. Поэтому часть больных туберкулезом отказываютсяпринимать эти препараты.

Кроме того, химиотерапевтические варианты для лечениятуберкулеза строго ограничены свойственной М. tuberculosis устойчивостью к большинствуклинически применяемых антибиотиков. Неправильное применение препаратов пациентамиилинеточное дозирование приводитк последовательному приобретению мутаций,обеспечивающих устойчивость и появление мультирезистентных штаммов М. Tuberculosis.Предполагается, что выходом из ситуации моют быть поиск или создание соединения, котороене является чужеродным для микроба и в естественных условиях регулирует ключевые моменты жизненного цикла возбудителя. Перспективными в этом плане представляются некоторые классы фосфолипидов и продукты их гидролиза, которые являются компонентамибактериальной мембраны.

Так, показано, что лизофосфатидная кислота при инкубации смакрофагами и альвеолоцитами А541 II типа повышала жизнеспособность этих клеток,инфицированных М. tuberculosis.. В работе [193] , проводимой нашим коллективом, различнымиметодами (в автоматизированной системе регистрации роста ВАСТЕС MG1T 960, ПЦР вреальном времени, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), окрашивание мазков поМурохаши)былоисследовановлияниемразличныхэкзогенныхфосфолипидов:фосфатидилхолина, кардиолипина и гликосфинголипидов на рост и жизнеспособность двухштаммов Mycobacterium tuberculosis , чувствительного к противотуберкулезным препаратам(ПТП), и клинического штамма MS-115, резистентного к ПТП I ряда.

Установлено,что такиелипиды, как фосфатидилхолин и гликосфинглипиды, не оказывали действие на микобактерии(М. tuberculosis H37Rv), а кардиолипин проявлял дозозависимое действие на оба штамма:89низкие концентрации КЛ (50, 125 и 250 мкг/мл) либо не влияли на рост (по данным ПЦР), либоприводили к задержке роста (поданным ВАСТЕС MGIT 960) обоих штаммов М. tuberculosis вто время как высокие концентрации кардиолипина (500 и 750 мкг/мл) приводили к полномуподавлению роста и гибели М. tuberculosis (поданным ОТ-ШДР).