Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств, страница 6

Гибридизационные свойства ЗНК при взаимодействии с ДНК и РНКа [44,48].ДуплексМодифицированныйДуплекс сПоследовательностьс ДНК;олгонуклеотидРНК; Тпл, ºСТпл, ºСДНК5'-d(GTGATATGC)2828 [44]β-D-ЗНК/ДНК миксмер5'-d(GTLGATLATLGC)4450 [44]β-D-ЗНК/РНК миксмер5'-r(GTLGATLATLGC)5563 [44]5'-(GTGATATGMeC)L6474 [44]5'-d(GαLTLGAαLTLAαLTLGC)3745 [44]5'-d(GMeTLGMeAMeTLAMeTLGMeC)3440 [48]Полностьюмодифицированная β-DЗНКα-L-ЗНК/ДНК миксмерМетилфосфонат-ЗНКмиксмера Ме( С-5-метилцитозин, ТL - ЗНК мономер, ТαL – a-L-рибо конфигурация мономера)Фармакокинетические параметры ЗНК были изучены на двух препаратах: SPC2996– 16-мер фосфотиоатЗНК (52, рис. 12) гэпмер, направленный против мРНК гена Bcl-2, иSPC2968 – 16-мер фосфотиоатЗНК гэпмер, направленный против мРНК гена Hif-2α.

Послевнутривенного введения грызунам и обезьянам было показано, что достигается быстроераспределение по тканям в течение 2-4 ч. За исключением головного и спинного мозга,костной ткани, половых желез и глазного хрусталика, оба препарата достигали похожихраспределительных профилей.

Период жизни олигонуклеотидов в тканях оказался равным18 дням, что превышает показатели фосфотиоатов [49].ЗНК являются удобными праймерами для аллель-специфической ПЦР и ПЦР собратной транскрипцией. ЗНК находят свое применение в качестве молекулярныхинструментов для определения короткоцепочечных фрагментов малых некодирующихРНК [50-52], либо выявления однофрагментных мисматчей в ДНК или РНК молекулах[53]. ЗНК были использованы в регуляции (включения и выключения) процессасплайсинга в клетках мыши [54].Миметики на основе морфолинаОбщая характеристикаВ конце 80-ых годов прошлого века группой ученых во главе с James E.

Summertonбыли разработаны миметики, получившие название морфолино-олигомеры (МО). В этихолигомерах дезоксирибоза заменяется морфолиновым циклом, а фосфодиэфирные связи28становятся фосфодиамидными (рис. 13). Также как и метилфосфонаты, МО имеютнезаряженный остов, но это несильно снижает их растворимость. В тоже времяморфолино показывают более высокую аффинность связывания с ОН (ОДН), чемфосфотиоаты. Также МО обладают высокой биологической стабильностью [55].BO1 2ON N3PO 4OBONOBNPOONРисунок 13. Структура морфолино олигонуклеотидов.МО в своей структуре имеют 4 связи на одну мономерную субъединицу, которыеподвергаются относительно свободному вращению (рис.

13). МО за счет такой структурыпоказывают низкий потенциал самоагрегации. Такой низкий потенциал особенно полезенпри связывании МО с длинными (20-30 оснований) цепочками РНК-мишеней,препятствуя неспецифичному взаимодействию между нуклеиновыми основаниями МО[55].Синтез миметиков на основе морфолинаСинтез МО является довольно простым и малозатратным, не требуя дляобразования фосфодиамидных связей дорогостоящих катализаторов и реагентов.Морфолино мономеры получают из природных рибонуклеозидов (рА, рС, рG), в качествеисходного вещества для четвертого мономера используется синтетический рибонуклеотидрТ вместо натурального рU, в качестве защитных групп экзоциклических аминогруппнуклеиновых оснований для цитозина и аденина используют бензоильную защитнуюгруппу, а для гуанина – фенилацетильную защитную группу (схема 8).

Ключевымиэтапами синтеза морфолино мономеров являются следующие стадии: окислительноераскрытие5-членногокольцарибозыс61образованиемдиальдегида62;восстановительное аминирование получившегося диальдегида 62 с аммиаком, чтоприводиткобразованию6-членногокольцаморфолина63споследующимвосстановлением 2' и 3'-гидрокси групп, что делает возможным получить мономер 64. Всеэтиреакциивыполняютсяпоследовательноводномреакционномсосудебезпромежуточной очистки интермедиатов. Введение тритильной защиты на вторичнуюаминогруппу морфолина, за которым следует присоединение хлорфосфоамидатной29функции к 5'-гидроксильной группе приводит к образованию фосфоамидатному синтонуна основе морфолина 65. Конечные фсофоамидатные мономеры имеют длительныйпериод хранения в течение нескольких месяцев при температуре -20ºС [55].Схема 8. Синтез мономеров МО [55].HOOHOHOBNaIO4BOOH OH61HOOO62ClHOOB1.

TrtCl, DCMNHBNH63OHPNOOB65ClNNBH3OPOCl2.ONH3N64OOONHB=HNHNNHПолучениеNNONHморфолиноONHONNNHNолигомеровсостоитизNHNONHконденсациисубъединицциклических аналогов и удаления защиты с N-конца действием раствора цианоуксунойкислоты в смеси CH3CN/DCM (схема 9) [55]. Стадия кэппирования не используется,потому что эффективность конденсации и удаления защиты являются крайне высокими(около 99.7 % для каждой стадии).

Около 80 % растворителей, используемых в стадияхпромывки, могут быть собраны, перегнаны и заново использованы. Эта рекуперацияпозволяет сэкономить значительные материальные потери при синтезе. Также ввидувысокойстабильностиактивированныхморфолиносубъединиц,ихизбытки,используемые для проведения стадии конденсации до полного превращения, могут бытьсобраны и использованы заново. Такая экономия имеет крайне важное значение приразработке технологии производства МО в качестве терапевтических препаратов.30Схема 9.

Твердофазный синтез МО [55].смолаO64OBNHClBNPO OON65BBONPOONOсмолаON66BBOсмолаNO67NPOOONHМорфолино остов стабилен при действии сильных оснований, но в среднекислыхсредахонрасщепляется,например,придействиитрифторуксуснойкислоты.Чувствительность МО к действию кислот вводит некоторые ограничения на возможныехимические процессы, но в тоже время такая чувствительность имеет одно значительноепреимущество ‒ это быстрое и легкое подтверждение последовательности олигомеров. Вэтомметоденебольшаяпорциясмолысприкрепленнымкнейолигомеромобрабатывается трифторуксусной кислотой (в течение 40 минут при комнатнойтемпературе), чтобы произвести одно удаление на олигомерной цепи.

Смола промываетсядля удаления TFA и 3'-концевого фрагмента, после чего добавляют гидроксид аммониядля того, чтобы отщепить оставшийся олигомер от смолы и удалить защитные группы снуклеиновых оснований. Масс-спектроскопия позволяет оценить последовательность припомощи вычисления дифференциалов масс между соответствующими фрагментами пиков[55].Свойства и применение миметиков на основе морфолинаНезаряженные фосфоамидатные морфолино-олигомеры хорошо растворимы вводе. Морфолино-олигомеры устойчивы к действию нуклеаз и другим факторамдеградации в биологических системах.

Поэтому, они эффективны в экспериментах31длительного времени, и мало подвержены побочным реакциям, что обеспечивает низкуютоксичность. Флуоресцеинмеченные морфолино-олигомеры, помещенные в клеткираспределяются по всему цитозолю и клеточному ядру, тем самым, имея доступ к РНКмишеням, как во время короткого пребывания РНК в ядре, так и их длительногонахождения в цитозоле [45].МО принадлежат к РНКаза Н-независимым олигомерам, в целом, они эффективныпротив большинства последовательностей 15-20 оснований (МИД морфолино олигомеров– 15 п. о.

[54]) от 5'-кэп участка до AUG трансляционного сайта любой выбранной мРНК.Такой небольшой сайт связывания некритичен в случае РНКаза Н-независимыхолигомеров, подобных МО, так как требуется, чтобы их целевые последовательностибыли отличны от около 2-5% последовательностей, содержащихся в цитоплазме(остальные 95-98% - это интроны и последовательности не более 25 оснований от 3' концадо участка начала трансляции). Таким образом, МО могут эффективно достигатьнаилучшей специфичности, что является немаловажным свойством антисмысловыхолигонуклеотидов [45].Аффинность связывания с комплементарными последовательностями ОН (ОДН)относительно нечувствительна к ионной силе среды.

В случае ДНК/ДНК и ДНК/РНКкомплексовтемператураплавлениязначительноуменьшаетсясуменьшениемконцентрации хлорида натрия в водном растворе. В случае же комплексов ДНК (РНК) сМОтемператураустойчивостикомплексаостаетсяпочтинеизменной.Такаянезависимость от ионной силы среды дает преимущество перед анионными ДНК и РНК вприменении в качестве диагностикумов в физиологической среде [55].МО/РНК дуплекс более стабилен, чем соответствующий ДНК/РНК дуплекс, атакже более стабилен, чем соответствующий фосфотиоат/РНК дуплекс [13, 55] (табл. 5).Таблица 5.

Сравнение устойчивости комплексов миметиков нуклеиновых кислот сРНК [13, 55].Комплементарный олигонуклеотид,Температура плавления дуплекса, оСсвязанный с РНК (5'GGUGGUUCCUUCUCAGUCGG)ДНК68.5Фосфотиоат77.3Морфолино олигомер81.3Фармакокинетические параметры морфолино-олигомеров были получены приэкспериментахнакрысах.МОлегкоабсорбируютсявкровотоке,показываяабсорбционный период между 0.7 и 1 ч. При этом, почки и печень представляют32первоначальные органы аккумуляции МО, тогда как мышечная ткань и Т-лимфоцитыпредставляют места с наименьшим содержанием МО.