Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств, страница 5

о. [13].В ходе исследования G-квадруплексов, образованных фосфотиоатами [37], былопоказано, что комбинирование диастереомеров фосфотиоатов демонстрирует различнуютермическую стабильность образованных комплексов. Фосфотиоаты показывали болеевысокие температуры плавления образованных ими G-квадруплексов по сравнению с Gквадруплексами ДНК, причем (R/S)- и (R)-фосфотиоаты показывали бифазные кривые21плавления(сдвумяточкамиперегиба),аобразованныйG-квадруплекс,(S)-фосфотиоатами показывал монофазное плавление.

Наилучшую аффинность связывания сДНК продемонстрировал олигонуклеотид, построенный из (R)-диастереомеров (табл. 3)[39].Таблица 3. Взаимодействие фосфотиоатов с ДНК [38].Температураплавления,оСДНКпоследовательностьВидG-антиссмысловогоквадруплеолигонуклеотидаксаДНК-TTAGGGTTAGGG36.5олигонуклеотидTTAGGGTTAGGG(R/S)-фосфотиоат35.5; 51.2TTAGGGTTAGGG(R)-фосфотиоат39.4; 54.4TTAGGGTTAGGG(S)-фосфотиоат49.6Фосфодитиоаты в отличие от моно-аналогов не имеют дополнителного хиральногоцентра по атому фосфора. Температура плавления их дуплексов с ОН (ОДН) нижеотносительно моно-аналогов, так для дуплекса длиной 17 п.

о., образованный ДНК ифосфотиоатом, температура плавления составила 52оС, дуплекс с фосфодитиоатомплавился при 42оС [28].Фосфотиоаты склонны к образованию комплексов с белками. Они селективносвязываются с полимеразами, такими как обратная транскриптаза ВИЧ и полимераза HSV(вирус герпеса). Прямое сравнение, используя пробу с32Р-концевым меченнымолигомером, было проведено на альбумине человеческой сыворотки, так 25±6% от ДНКучаствовало в связывании с участком 17-мера антитела к β-глобину, такая жепоследовательность S-олигонуклеотида показала 66±3% связывания. Такое неселективноесвязывание значительно осложняет in vivo применение.

Фосфодитиоаты образуют болеепрочные комплексыс белками,чтоделаетселективность ингибирования дляфосфодитиоатов ниже, чем у фосфотиоатов [28].Фосфотиоаты способны проникать через клеточную мембрану, концентрируясь вклетке. Процесс проникновения включает связывание с мембраной клетки и последующийэндоцитоз.Послечегофосфотиоатысвязываютсясядернымикомпонентами.Фармакокинетика фосфотиоатов была хорошо изучена на их аналогах. Так 2'22метоксиэтильные (2'-ОМОЕ) модификации (рис.

7) показывают быстрое распределение изкровотока к тканям (от 30 мин до 2 ч) при использовании инъекции в качестве методавведения раствора олигомера, лишь малая часть олигонуклеотидов проникает в плазму.Такие МОЕ-миксмеры циркулируют в крови, связываясь с белками крови, но не проникаяв красные кровяные тельца.

Менее чем 10% от введенной дозы таких олигонуклеотидовобнаруживается в моче спустя 24 ч после введения препарата. Биораспределениеохватывает большое количество органов, наиболее высокие концентрации наблюдаются впочках, печени, селезенке, лимфатических узлах, костном мозге. Такие аналоги ОДНпрактически не обнаруживаются в мышечной ткани, легких и сердце, а также непроникают в мозг через ГЭБ при инъекции. В тоже время, варьирование числафосфотиоатных связей с фосфодиэфирными в цепи олигомера изменяет биораспределениесреди тканей, так уменьшение числа фосфотиоат нуклеотидов приводит к ухудшениюбиодоступности антисмысловых олигонуклеотидов в печень и другие ткани, увеличиваяпроникновение в почки с дальнейшим выведением вместе с мочой.

Такая отличительнаячерта в фармакокинетике фосфотиоат олигонуклеотидов может быть использована длянацеливаниянаопределенныйобъекторганизма[40].Такжедляулучшениябиодоступности используются различные конъюгаты фосфотиоатов, например, суглеводами [41].Фосфотиоаты показывают хорошее связывание при взаимодействии с человеческойтеломеразойимогутбытьиспользованывпротивоопухолевойтерапии[39].Антисмысловая олигонуклеотидная терапия фосфотиоатами, как было показано, можетбыть применена против ВИЧ и вируса гепатита В [42, 43].«Замкнутые» нуклеиновые кислотыОбщая характеристика«Замкнутые» нуклеиновые кислоты (ЗНК) (рис. 10) были разработаны группой подруководством Jesper Wengel в середине 90-ых годов [44, 45].BOOBO-O OP OOOBOO OP OOOOO OP OOРисунок 10.

Структура «закрытых» нуклеиновых кислот.23Анализ данных, полученных при компьютерном моделировании, показал, что 2'-О4'-С-аналоги рибонуклеотидов являются очень перспективным для антисмысловыхтехнологий из-за сильных конформационных затруднений в молекуле олигомера. Поэтомуза основу структурного звена был выбран2'-О,4'-С-метилен-β-D-рибофуранозилнуклеотид, в котором фуранозное кольцо будет находиться в конформации N-типа (рис.11), что приводит к образованию более прочного комплекса при связывании с РНК [44].OOOOBaseOOO P OOO P OOBase-OO P ON-ТипДНКOOO P OS-ТипOBaseOBaseOO P OOOBaseOЗНКРисунок 11. Возможные конформации ДНК и ЗНК [43].После первого поколения ЗНК, ряд структурных аналогов ЗНК был синтезирован иисследован в ходе различных экспериментов. Хотя большинство членов ЗНК «семейства»(42-53) (рис.

12) показывают высокую аффинность связывания с ОН (ОДН), лучшуюэффективность гибридизации показывают β-D-ЗНК (“классических” ЗНК) 42 из всехдиастереомерных форм. Среди других стереоизомеров, α-L-ЗНК 44 привлекают внимание,таккаконидемонстрируютвысокуютермостабильностьлишьслегканиже“классических” ЗНК.

Такая аффинность связывания и специфичность, полученные для βD-ЗНК 42 и α-L-ЗНК 44 делает такие молекулы многообещающими миметикаминуклеиновых кислот [46].24OOOO P OOOO-O-D-ксило-ЗНК43ЗНК(-D-ЗНК)BaseO OO O O BaseO P OO OBaseOBaseO P O--L-ЗНКOO P O-L-ксило-ЗНК444542OBaseO P OOOO P O-L-ЗНКBaseO-OO P OOOS-OO P O-L-ксило-ЗНК4849ONHOBaseOOS P OOOOH3C P Oфосфоротиоат-ЗНКаминоЗНКтиоЗНК50OO P OBaseO-D-ксило-ЗНК-BaseO P OO OOBaseOBaseO-D-ЗНК4746OO OOOOOOметилфосфонатЗНК535251BaseРисунок 12. Различные модификации ЗНК [46].В тоже время разные молекулы ЗНК показывают различные фармакокинетическиепрофили,чтодаетвозможностьдляконструированияЗНКподконкретнуюбиологическую мишень.Синтез «замкнутых» нуклеиновых кислотСинтезолигомеризацииЗНК-олигомеровпроизводитсяЗНК-фосфоамидитовнаДНК-синтезаторе(аналогичноприпомощиприготовлениюДНКолигонуклеотидов, используя фосфоамидитный метод).

Первый шаг в синтезе ЗНКнуклеотидов заключается в получении соответствующих ЗНК-нуклеозид диолов (схема 6)[44, 46]. Синтез начинается с 1,2:5,6-ди-О-изопропилиден-α-D-аллофуранозы 54, которыйпосле введения бензильной защиты и удаления изопропилиденовой защиты подвергалипериодатному окислению с последующей реакцией Канниццаро, что приводило кобразованию диола 55. Ключевой фуранозный интермедиат 56, который являетсяподходящим субстратом для соединения с различными нуклеиновыми основаниями,может быть получен димезилированием 4'-С-гидрометилфуранозы 55. После этогофуранозное производное подвергают ацетолизу. После реакции стереоспецифического β25гликозилирвоания нуклеинового основания, производное 57 подвергают циклизации, чтоприводит к образованию защищенного 2'-O,4'-C-метилен-β-D-рибофуранозил нуклеозида58. Удаление оставшейся мезил группы нуклеозида 58 реакцией с бензоатом натрия, закоторой следует дебензилирование дают конечный ЗНК нуклеозид диола 59.

Суммарныйвыход ЗНК нуклеозида 59, начиная с 1,2:5,6-ди-О-изопропилиден-α-D-аллофуранозы 54составляет 43%.Схема 6. Синтез нуклеозидов ЗНК [44, 46].OO1. BzlBr, NaH2. AcOHOMsOHOO3. NaIO4, H2OO 4. HCHO, NaOH, H2OOOH OOBn OHO5455DCE, Thy,MSOTf2. Ac2O, AcOH,H2SO4 MsOOOBnMsONaOHBOAcOAcOBnHO1. NaOBz2. 2M NaOHBO57OBnOAc56MsOMsOO1. MsClO583. 20% Pd(OH)2/CHCOONH4, CH3OHOOHBO 59B= T, CBz, ABz, GiBuПриготовление ЗНК-олигомеров схоже с получением ОН (ОДН), используятехнологию твердофазного синтеза, основанную на синтезе фосфоамидитных синтонов 60(схема 7) и их олигомеризацию на полимерном носителе.Схема 7.

Синтез ЗНК-фосфоамидитов.DMTrOBOHOBOOH1. DMTrCl, PyO 592.NNPNOOPO 60OCNCN4,5-цианоImПолимерныйноситель,ккоторомуприсоединенподходящийнуклеозидподвергается удалению DMTr-защитной группы с 5'-ОН группы нуклеозида. Далеефосфоамидит 60 присоединяется в присутствии активатора. Непрореагировавшиегидроксильныегруппыкэппируютсяипоследующееокислениепревращаетфосфиттриэфир в фосфаттриэфирные связи. Цикл превращений повторяется до получения26олигонуклеотида желаемой длины. После этого происходит удаление защитных групп,отщепление с носителя и выделение полученной последовательности [44, 46].

Также ЗНКнуклеотиды могут быть введены в цепь ДНК при помощи ферментов [47].Свойства и применение «закрытые» нуклеиновых кислотПолностью модифицированные β-D-ЗНК 42 и α-L-ЗНК 44 стабильны при действииS1-эндонуклеазы, тогда как миксмеры ЗНК/ДНК подвергаются деградации в тех жеусловиях. ЗНК-ДНК-ЗНК гэпмеры и ЗНК-ДНК миксмеры стабильны в сыворотке крови.Дуплекс полностью модифицированного β-D-ЗНК 42 олигомера с РНК не являетсясубстратом для действия РНКазы Н, в тоже время α-L-ЗНК-РНК гибрид выступает в ролисубстрата, но скорость расщепления РНК, в этом случае, значительно ниже по сравнениюс действием РНКазы Н на ДНК/РНК дуплекс.

ЗНК олигонуклеотиды показываютпревосходную растворимость в водных системах [44].Потенциал ЗНК действовать в качестве терапевтических инструментов основан наих способности образовывать высокопрочные комплексы с комплементарными РНК,также как с одноцепочечными ДНК, без потери специфичности к последовательности.Фактически,ЗНКпоказываютселективностьсвязываниясильнопревышающуюселективность связывания ОН (ОДН). Распознавание комплементарных нуклеиновыхкислот ЗНК-типом олигомеров происходит при помощи образования водородных связеймежду нуклеиновыми основаниями в соответствии с Уотсон-Криковскими правиламисвязывания [44].Гибридизационные свойства ЗНК были оценены на последовательности из девятинуклеиновых оснований (табл. 4).

Замена трех нуклеотидов в ОН (ОДН) на мономеры βD-ЗНК приводила к увеличению температуры плавления дуплексов от +9 до +27оС вслучае дуплекса с ДНК и от +12 до +35оС в случае дуплекса с РНК. Полностьюмодифицированные ЗНК показывали наиболее высокую аффинность связывания с ДНК(РНК) при замене цитозина на 5-метилцитозин [45]. Из-за слишком сильного связывания вЗНК-ЗНК дуплексе, при конструировании ЗНК следует избегать большого числасамокомплементарных участков последовательности или же использовать миксмеры ЗНКс ОН (ОДН), либо с другими аналогами ОДН [48].27Таблица 4.