Диссертация (Комплексные соединения редкоземельных элементов с биологически активными лигандами на примере антипирина), страница 13

М.В. Ломоносова ст.н.с., к.х.н. Федорова Г.А.633.2.3. ИК– и КР-спектроскопия3ИК-спектры поглощения были сняты в интервале 400–4000 см–1 и 600–50 см–1 (ИКФурье спектрометр EQUINOX 55, «BRUKER», Германия) в суспензии с вазелиновым масломили в таблетках KBr. Спектры КР в диапазоне 90–3300 см–1 были получены на Фурье-Раманспектрометре RFS100/S (Bruker). В качестве источника возбуждения использовалось излучениеNd:YAG лазера с длиной волны 1.06 μm.3.2.4. Рентгенофазовый анализ4Дифрактограммы образцов были получены на приборе Shimadzu XRD-6000, (CuKαизлучение, графитовый монохроматор) в интервале углов 10– 80о с шагом 0.02о, в непрерывномрежиме.3.2.5. Рентгеноструктурный анализ5Экспериментальные интенсивности дифракционных отражений кристаллов получалипри комнатной температуре (293(2)K) на дифрактометре EnRaf-Nonius CAD – 4 [231] (Cu-, Моили Ag Кα-излучение, графитовый монохроматор, /2, ω-сканирование), а также при 173.15 и180.15 К на дифрактометрах CCD area detector и Bruker Venture D8 (Mo-Кα-излучение,графитовый монохроматор)6.

Поправка на поглощение приведена методом ψ-сканированияотдельных рефлексов. Первичную обработку массива экспериментальных данных проводилипо комплексу программ WinGX [232], все последующие расчеты – по SHELXL-97.Визуализация строения соединений осуществлялась с помощью программы MERCURY [234].3.2.6. Термический анализ7Термический анализ проводили на синхронном (TG-DSC) дифференциальном сканирующемкалориметре STA – 409 фирмы Netzsch (Германия) в тиглях из оксида алюминия с крышечкамив атмосфере гелия в интервале температур 20–300 °С и cо скоростью изменения температуры10°/мин. Сенсор представлял собой чувствительную контактную площадку на основе платинородиевых термопар, погрешность в измерении температуры которых составляла 0.02° С.Калибровка сенсора осуществлялась по реперным веществам: In, Sn, Zn, Al, Ag, Au.Отклонение от реперных температур не превышало 0.1-0.2° С, а погрешность измерениятемпературы3составляла (0.2)2  (0.02)2  0.2 C .ПроводиласьИК-спектры были сняты в ЦКП ФГБОУ ВПО «МИТХТ» ст.

н.с., к.х.н. В.В. Кравченко.Спектры КР были сняты в ИСАН РАН гл. н.с., д. ф.-м. н. Б.Н. Мавриным.4Дифрактограммы порошков были сняты в ЦКП ФГБОУ ВПО «МИТХТ».5РСА монокристаллов проводил м.н.с., к.х.н. Д.В. Альбов (Химфак МГУ).6РСА монокристаллов проводила гл. н. с., д.х.н., проф. Л.Г. Кузьмина (ИОНХ РАН).7Термический анализ проводился ст.н.с., к.х.н. С.Н. Мудрецовой (Химфак МГУ).такжекалибровка64чувствительностидляопределенияэнтальпииразложения.Но,дляпредупреждениязагрязнения калориметра продуктами разложения, эксперимент заканчивался сразу послеопределениятемпературыразложениякомплексов.Температурафазовыхпереходовопределялась с помощью программы фирмы Netzsch (Германия) автоматически.Как правило, проводят минимально 3 измерения (получение базовой линии, калибровкаприбора и измерение для исследуемого образца):1) Получение базовой линии (тигель эталона и тигель образца пустые) (Рисунок 25).Рисунок 25.

Схема получения базовой линии.2) Калибровочный цикл (тигель эталона пуст, а стандартное вещество с известнойтеплоемкостью помещается в тигель образца, Рисунок 26).Рисунок 26. Схема калибровочного измерения.3) Цикл с исследуемым образцо: исследуемое вещество помещается в тигель для образца, атигель эталона пуст (Рисунок 27).Рисунок 27. Схема проведения измерения для исследуемого вещества.3.2.7. Изучение цитотоксичности8ЦитотоксичностьполученныхсоединенийопределялиспомощьюМТТ-теста,основанного на восстановлении бесцветной соли метилтиазола тетразолия (бромида3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия, МТТ) посредством митохондриальных ицитоплазматических дегидрогеназ живых метаболически активных клеткок с образованиемвнутриклеточных голубых кристаллов формазана, растворимых в диметилсульфоксиде (ДМСО)[235, 236].8Исследования выполнялись в лаборатории роста клеток и тканей Института Теоретической иЭкспериментальной Биофизики РАН (г.

Пущино) к.ф.-м. н., ст.н.с. Давыдовой Г. А. и асп. Мироновой Е. А.65Жизнеспособность клеток в присутствии тестируемых соединений изучалась нафибробластах линии NCTC clone L929, полученных из клеток подкожной соединительнойткани мышей С3H/An [237] (flow laboratory, Great Britain), и на эпителиальных клетках линииНер-2 (эпидермоидная карцинома гортани человека [238]) из коллекции НИИ вирусологии им.Д.И.

Ивановского РАМН, г. Москва. Клетки высевали в лунки 96-и луночного планшета приплотности 25-30 тыс. клеток/см3 в среде DMEM/F-12 (1:1), содержащей 5% (v/v) эмбриональнойтелячьей сыворотки (FBS). Через 18 ч. среду удаляли и добавляли 100 мкл раствораисследуемого соединения в DMEM/F12, содержащего 0.001, 0.01, 0.1 или 1 мг/мл, или готовилирастворы в интервале концентраций 1.10-7–1.10-3 моль/л путем последовательного разбавления в10 раз. Клетки инкубировали в течение суток при 37º C в атмосфере 5% СО2 при 90%-нойвлажности воздуха. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл вDMEM/F12).

Планшеты помещали в СО2-инкубатор на 3 часа (37º C, в атмосфере 5% СО2 и90%-ной влажности воздуха). Затем среду удаляли, в лунки вносили 100 мкл ДМСО иинтенсивно встряхивли в течение 10 минут, до полного растворения формазана. Развитиеокраски регистрировали путем измерения оптической плотности при длине волны 540 нм влунках 96 луночного планшета с помощью фотометра (модель 680 BIO-RAD, США). В качественегативногоконтроляпрохожденияМТТ-тестаиспользовалидобавлениевсредукультивирования клеток 10% ДМСО.

В качестве общего контроля использовали клетки,культивируемые в среде ДМЕМ/F12, не содержащей сывороточных факторов прикрепления.Каждое значение представляет собой среднее из трех отдельных экспериментов.Статистически значимые различия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента(р = 0.95).Оценку морфологии и жизнеспособности клеток, культивируемых на поверхностиподложки и в растворе исследуемых соединений, проводили на микроскопе Axiovert 200. Былприменен метод флуоресцентного окрашивания клеток с использованием L-7007 LIVE/DEADBacLight Kit (Invitrogen) с флуоресцентными красителями SYTO 9 (поглощение- 420 нм,эмиссия -580 нм) и иодидом пропидия (поглощение 488 нм, эмиссия 640 нм).

Все клетки SYTO9 окрашивает в зеленый цвет, в то время как иодид пропидия окрашивает ядра погибших клетокв красный цвет. Красители добавлялись в среду (5 мг/мл), затем планшет помещался в СО2инкубатор на 15 минут, затем проводилась микрофотосъемка клеток.Кроме того, для [Ln(AP)6]X3 (Ln = La, Gd, Lu, X = I–, ClO4–) было проведеноэкспериментальное исследование цитотоксичности, или противоопухолевой активности in vitro,в Национальном институте рака (США), в рамках соглашения между МИТХТ и NCI, поотношению к клеткам 60 линий 9 различных опухолей человека (рака легкого, толстой кишки,66центральной нервной системы, яичника, почки, простаты, молочной железы, меланомы,лейкоза) по методике, подробно описанной в [239].Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 5% сыворотки крупногорогатого скота и 2 мМ L-глутамина в 96 луночных планшетах в течение 24 ч.

Затем добавлялииспытуемое соединение до концентрации 10-5 моль/л. Через 48 час клетки отмывали оттестируемых соединений и добавляли на 10 мин краситель сульфородамин В. Связанныйживыми клетками краситель переводили в растворимую форму. Оптическая плотностьполученного раствора пропорциональна количеству живых клеток.

Фотометрическим методомопределяли оптическую плотность ( = 515 нм) раствора красителя в культурах клеток после48-часового культивирования в присутствии соединений (Ti), в контрольных культурах клетокв момент времени z перед добавлением соединений в опытные культуры (Tz) и в контрольныхкультурах, культивируемых с момента времени z в течение 48 час без испытуемых соединений(С). Выживаемость клеток рассчитывали по формуле:[(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 для случаев, если Ti>/=Tz, и по формуле[(Ti-Tz)/Tz] x 100 для случаев, если Ti<Tz (случаи, когда соединения индуцируют гибельклеток).

В соответствии с критерием, принятым в Национальном институте рака, веществасчитаются активными в случае, если они ингибируют рост клеток до 32% от контроля иливызывают их гибель. В отечественных исследованиях соединения квалифицируются какперспективные для проведения более углубленных исследований при ингибировании ростаклеток до 50% от контроля [240].673.2.8. Квантово-химические расчетыКвантово-химические расчеты осуществлялись в рамках теории функционала плотности(DFT, обменно-корреляционный функционал PBE) c помощью программы «Природа» [241244].

В связи с наличием тяжелых элементов, для которых влияние релятивистских эффектов наструктурные и спектральные характеристики заметное, применяли скаляр-релятивистскоеприближение с полноэлектронным базисным набором L11 [242]. Для оптимизации задачиточность расчета–продолжительность расчета, были рассчитаны геометрические параметры(длины связи Gd–O, а также валентные углы O–Gd–O) на примере аквакатионов гадолиния(III)[Gd(H2O)8]3+, [Gd(H2O)9]3+ (Рисунок 28, Таблица 3). Как видно из представленных данных,базисный набор L11 оказался наиболее пригодным для рассматриваемого типа соединений,поскольку расчетные значения геометрических параметров в этом случае менее всегоотличались от экспериментальных при сопоставимой продолжительности расчета.

Для[La(AP)6]3+ использовался также базисный набор с эффективным потенциалом ECP SBK,однако при этом получались завышенные значения длин связей (на 0.044 Å) и заниженныезначения энергии связи Ln–O (на 2.6 ккал . моль–1) [210]. Комплексы металлов с открытымиоболочками (все лантаноиды, кроме лантана и лютеция) рассчитывали с применением спиннеограниченного метода DFT (UPBE). Оптимизацию геометрии проводили без ограничений намолекулярнуюсимметрию.Стационарныйхарактероптимизированныхструктурподтверждался отсутствием мнимых частот в рассчитанном колебательном спектре. Приоптимизации геометрии комплексов в качестве исходных были взяты атомные координаты,полученные в результате рентгеноструктурного анализа [164].Рисунок 28.

Строение [Gd(H2O)8]3+ (оптимизация методом DFT [223]) ирасчет в базисе L11 (выделены жирным шрифтом).68Таблица 3. Экспериментальные и расчетные значения длин связей (Å) ивалентных углов () для [Gd(H2O)9]3+ для различных базисных наборов.Базис/время расчетаL11/30L22/121SBK/16 minminmin2.4752.4852.5062.5222.5262.528Длины связейЭксперим.данные, [22]Gd – O (1)Gd – O (2)2.441(4)2.458(5)Gd – O (3)2.424(2)2.4752.4842.506Gd – O (4)2.424(2)2.4742.4852.506Gd – O (5)2.424(2)2.4752.4842.506Gd – O (6)2.453(3)2.5232.5242.528Gd – O (7)2.424(2)2.4752.4832.507Gd – O (8)2.441(4)2.4752.4852.506Gd – O (9)2.453(3)2.5222.5262.528Валентные углыO(4)– Gd –O(2)68.23(6)69.6169.5469.72O(4)– Gd –O(8)O(4)– Gd –O(6)138.00(6)68.68(8)138.5569.27139.2169.61139.6369.82O(4)– Gd –O(5)136.46(8)139.19139.10139.46O(4)– Gd –O(1)78.88(9)74.9674.3173.60O(4)– Gd –O(9)135.66(6)134.67134.26133.74O(4)– Gd –O(3)88.54(8)90.6891.5492.50O(4)– Gd –O(7)75.55(8)74.9274.4373.57O(2)– Gd –O(8)O(2)– Gd –O(6)137.89(8)118.30(8)134.61120.06134.18119.97133.78119.99O(8)– Gd –O(6)69.41(6)69.2869.6069.81O(8)– Gd –O(1)84.2(1)90.7691.6192.44O(6)– Gd –O(9)123.4(1)119.99119.85120.03694.