11156 (Маслянокислые бактерии как продуценты кислот), страница 2

1.2 Бактерии, участвующие в маслянокислом брожении

К клостридиям относят большое количество видов бактерий, число которых постоянно возрастает. Это один из самых крупных родов среди эубактерий. Принадлежность к роду определяется на основании только трех признаков:1)способности образовывать эндоспоры 2) облигатно анаэробного характера энергетического метаболизма 3) неспособности осуществлять диссимиляционное восстановление сульфата. Отсюда понятно, что эта группа эубактерий чрезвычайно гетерогенна, о чем, в частности, свидетельствует интервал значений ГЦ - оснований ДНК, молярное содержание которых с учетом описанных новых видов занимает область от 21 до 57%.

Из этого также можно сделать вывод, что организмы, объединенные в род Clostridium, нельзя рассматривать как эволюционно однотипные. Последующая характеристика их метаболических особенностей дает достаточно четкое представление об этом. Изучение эубактерий, относимых к клостридиям, наоборот, указывает на раннее расхождение видов рода в процессе эволюции. За исключением C. coccoides, вегетативные клетки бактерий из рода Clostridium имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек с закругленными концами. Большинство видов грамположительные, подвижные. Движение осуществляется с помощью перитрихиально расположенных жгутиков. По мере старения в процессе цикла развития клетки теряют подвижность, накапливают гранулезу (запасное вещество типа крахмала) и переходят к спорообразованию. Образующиеся споры овальной или сферической формы. Диаметр их, как правило, превышает диаметр вегетативной клетки, поэтому, если, формирующаяся спора расположена в центре клетки, последние меняют форму, становясь веретеновидными; если же споры образуются у одного из клеточных концов, клетки приобретают форму барабанных палочек.

Клостридии - облигатные анаэробы. Однако спектр их чувствительности к молекулярному кислороду достаточно широк, что связано с обнаружением в клетках большинства клостридиев супероксиддисмутазы и с другими приспособлениями на уровне клеточных популяций, помогающими нейтрализовать токсические эффекты О₂ и его производных. Именно при работе с клостридиями Л. Пастер в 1961г. открыл форму жизни без кислорода (Емцев, Мишустин, 2006).

В зависимости от вида сбраживаемого субстрата выделяют несколько физиологических групп клостридиев: сахаролитические клостридии, использующие в качестве субстратов брожения вещества углеводной природы (моносахара, крахмал, клетчатка); протеолитические клостридии, субстратами брожения которых являются белки, пептиды, аминокислоты пуринолитические клостридии, специфически приспособленные к сбраживанию гетероциклических соединений (пурины и пиримидины). Среди них есть виды, обладающие довольно широкими возможностями (субстратами брожения служат как углеводы, так и белки), и узкоспециализированные виды, способные использовать в качестве источника энергии и углерода какое-либо или очень небольшое число соединений.

Субстратом брожения сахаролитических клостридий является такие моносахара, как глюкоза, фруктоза, ксилоза и др. Некоторые виды могут использовать крахмал, целлюлозу, пектин, хитин, предварительно гидролизуемые соответствующими экзоферментами. Типичными представителями сахаролитических клостридий, осуществляющих классическое маслянокислое брожение, являются C. butyricum и C. pasteurianum.

Таблица 1. Основные продукты брожения некоторых сахаролитических клостридий, не образующих масляной кислоты.

К протеолитическим относятся клостридии, имеющие активные протеолитические ферменты и поэтому способные использовать в качестве субстратов белки и пептиды, гидролизуя их до аминокислот и подвергая затем последние сбраживанию. В эту группу входят C. putrificum, C. histoliticum, C. sporogenes и другие сапрофитные виды. Близки к этим видам и некоторые патогенные формы: C. botulinum – продуцент ботулина – экзотоксина, являющегося одним из самых сильных биологических ядов; C. tetani – столбнячная палочка, образующая в организме человека столбнячный токсин. К протеолитическим клостридиям примыкают виды, использующие в качестве источника углерода и энергии ограниченное число свободных аминокислот. Например, C. cochlearium растет только на среде с глутаминовой кислотой, глутамином и гистидином; C. sticklandii может сбраживать лизин, аргинин, фенилаланин, серин, а C. propionicum – треонин, аланин, серин, цистеин.

С жизнедеятельностью клостридий связаны различные процессы, протекающие в природе: разложение (гниение) азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот) в анаэробных условиях; анаэробное разложение растительных материалов, таких как клетчатка, хитин. Некоторые сахаролитические клостридии могут использовать в качестве субстрата брожения пектиновые вещества, составляющие покровы растительных клеток. Пектин — полимер метил-D-галактуроновой кислоты. Последняя имеет сложное строение и при воздействии на нее пектиновыми ферментами гидролизуется на ряд сахаров, кислот и метиловый спирт. Клостридии, принадлежащие к виду C felsineum, содержат активную пектиназу и могут, поэтому получать энергию, осуществляя маслянокислое брожение пектиновых веществ. Этот вид играет важную роль в процессе мацерации волокон при мочке льна.

Еще в конце прошлого века было обнаружено, что некоторые клостридии патогенны, т. е. вызывают заболевания человека и животных. В основе патогенности клостридиев лежит их способность синтезировать и выделять из клетки высокоэффективные токсины.

К возбудителям маслянокислого брожения относится в первую очередь вид Clostridium saccharobutyricum (Granulobacter saccharobutyricum). Клетки его цилиндрической формы, длиной от 4-5 до 7-12 мкм и толщиной от 0,5 до 1-1,5мкм, подвижные, спорообразующие. Перед образованием спор в них накапливается гранулеза. Спора появляется чаще в центре клетки, последняя возле споры расширяется (клостридий). Иногда спора располагается на конце клетки, форма которой приобретает вид ракетки (плектридий). Споры довольно устойчивые, они могут выносить непродолжительное кипячение в течение 1-2 мин.

Clostridium saccharobutyricum - облигатный анаэроб, с оптимальной температурой развития 30-40^оС, сбраживает многие углеводы и близкие к ним соединения с обильным выделением водорода и углекислоты при одновременном накоплении масляной кислоты. Последняя этими бактериями не потребляется. С.Н. Виноградским описан возбудитель маслянокислого брожения Clostridium pasteurianum, способный усваивать атмосферный азот. По многим признакам он сходен с предыдущим видом, но отличается от него биохимическими особенностям - он не сбраживает крахмал. К маслянокислым бактериям относится также вид Clostridium butyricum и некоторые другие представители. По отношению к источникам азота Маслянокислые бактерии весьма неприхотливы: они усваивают белковый, аминокислотный и аммонийный азот, а некоторые используют азот воздуха.

Маслянокислые бактерии являются также возбудителями ацетонобутилового брожения, анаэробного брожения клетчатки и брожения пектиновых веществ.

Ацетонобутиловое брожение представляет собой превращения углеводов бактериями с образованием ацетона и бутилового спирта. При этом брожении, кроме ацетона и бутилового спирта, вырабатываются также масляная и уксусная кислоты, водород и углекислый газ. Суммарно данное брожение можно выразить следующим уравнением:

12 С₆Н₁₂О₆ → СН₃СН₂СН₂СН₂ОН + 4СН₃СОСН₃ + СН₃СН₂ОН + СН₃СН₂СН₂СООН + 18Н₂ + 28СО₂ + 2Н₂О + Х кДж

Механизм ацетонобутилового брожения

Химизм ацетонобутилового брожения еще недостаточно выяснен. В последнее время для изучения его используют метод меченых атомов. В бродящую среду вводят промежуточные продукты брожения (уксусную, ацетоуксусную и масляную кислоты), содержащие углерод С¹³, а затем определяют наличие этого углерода в конечных продуктах. Этим способом установлено, что при добавлении уксусной кислоты с С₁₃ около 50% всего меченого углерода содержится в бутиловом спирте, около 15%- в ацетоне, до 18% - углекислом газе. При добавлении масляной кислоты, содержащей С₁₃, около 85% меченого углерода переходит в бутиловый спирт. Он найден также в этиловом спирте, в уксусной и масляной кислотах. Исходя из этих данных, считают, что образование бутилового спирта идет главным образом через масляную кислоту. Кроме того, полагают, что ацетон образуется через масляную кислоту.

В химизме ацетонобутилового брожения имеется много общего с маслянокислым, а частности, первые стадии до образования ацетольдоля протекают подобно маслянокислому брожению. Далее между двумя молекулами ацетальдоля протекает окислительно – восстановительная: оксимасляная кислота и оксибутиловый спирт по следующему уравнению: реакция, в результате которой образуются два соединения: β - оксимасляная кислота и β - оксибутиловый спирт по следующему уравнению:

2СН₃СНОСН₂СНО + Н₂О → СН₃СНОНСН₂СООН + СН₃СНОНСН₂СН₂ОН

β - Оксимасляная кислота далее отщепляет водород и переходит в ацетоуксусную кислоту, которая затем распадается на ацетон и углекислый газ:

СН₃СНОНСН₂СООН → СН₃СОСН₂СООН → СН₃СОСН₃ + СО_в –

оксибутиловый спирт подвергается восстановлению до n - бутилового спирта согласно уравнению:

CН₃СНОНСН₂СН₂ОН + Н₂ → СН₃СН₂СН₂СН₂ОН + Н₂О

Часть уксусного альдегида, по-видимому, также вовлекается в окислительно-восстановительную реакцию с образованием уксусной кислоты и этилового спирта:

СН₃СНО + СН₃СНО + Н₂О →СН₃СООН + СН₃СН₂ОН

В ацетонобутиловом брожении наблюдаются две фазы: первая - кислотная, во время которой усиленно размножаются бактерии, а в среде накапливаются масляная и уксусная кислоты, и вторая - ацетонобутиловая, в ней уменьшается кислотность и происходит усиленное накопление ацетона, бутилового и этилового спиртов. В зависимости от условий брожения, т. е. подавляя какую – либо фазу брожения, можно получить усиленное накопление тех или иных продуктов. Следовательно, ацетонобутиловое брожение отличается от маслянокислого: при маслянокислом брожении накапливающиеся кислоты постепенно замедляют процесс кислотообразования и даже останавливают его, а при ацетонобутиловом – образовавшиеся кислоты потребляются бактериями и превращаются в другие вещества.

Первый возбудитель ацетонобутилового брожения выделен в 1911 г. Бейеринком. Он получил название Granulobacter butyricum. Более активным возбудителем этого брожения явился вид Clostridium acetobutyricum. Клетки его по морфологическим признакам сходны с маслянокислыми бактериями. Это подвижные, грамположительные, палочки со спорами, развивающиеся в анаэробных условиях. Спорообразование - клостридиальное. В клетках накапливается гранулеза. По биохимическим свойствам данный вид сильно отличается от маслянокислых бактерий. Начиная с 1923 г. ацетонобутиловые бактерии используются в промышленных масштабах для получения ацетона и бутилового спирта из крахмалистого сырья и мелассы.

Среди возбудителей маслянокислого брожения встречаются такие культуры, которые способны вызывать брожение клетчатки. Способность анаэробных микроорганизмов разрушать клетчатку впервые была установлена в 1875г. Л. Поповым, а сущность этого процесса раскрыта в 1889- 1902 гг. В. Л. Омелянским, который выделил две разновидности целлюлозоразрушающих бактерий. Одна из них вызывает водородное брожение клетчатки Bac. cellulosae hydrogenicus ,а вторая – метановое Bac. cellulosae metanicus. У этих бактерий морфологических различий почти не наблюдается. Молодые формы - необычайно тонкие, прямые, иногда слегка изогнутые палочки, толщиной от 0,3 до 0,5 мкм и длиной от 4 до 8 мкм. По мере развития палочки удлиняются и достигают 10-15 мкм, затем на их конце их образуются споры. При этом клетки приобретают форму барабанной палочки. Со временем спора в виде круглого тельца освобождается от клетки. Одним из существенных морфологических различий между водородными и метановыми бактериями является разная способность к спор к прорастанию. Споры возбудителя метанового брожения прорастают намного быстрее спор водородного брожения.

Химизм этого брожения сложен, так как целлюлозоразлагающие бактерии сначала переводят углеводы в растворимые сахара, которые затем частично сбраживают главным образом до масляной и уксусной кислот. Из других продуктов эти бактерии продуцируют спирт, муравьиную и молочную кислоты, а также выделяют газы - водород или метан (в зависимости от культуры) и углекислый газ.

При водородном брожении газообразные вещества - водород и углекислота - составляют примерно 1/3 массы разложившейся клетчатки. При метановом брожении газообразных веществ (метана, углекислоты) получается больше, они составляют примерно половину массы разложившейся клетчатки.

Возбудители водородного и метанового брожения наряду с клетчаткой способны сбраживать соли масляной, молочной, муравьиной и других кислот, накапливающиеся при брожении клетчатки. В результате такого процесса в анаэробных условиях достигается полная минерализация клетчатки - наиболее сложного и устойчивого полисахарида. В последнее время установлено, что возбудители маслянокислого брожения клетчатки являются активными продуцентами витамина В₁₂. Это свойство их используется для промышленного получения кормового витамина В₁₂.