11156 (Маслянокислые бактерии как продуценты кислот), страница 3

Пектиновые вещества входят в состав тканей растений. Являясь составной частью клеточной оболочки, они как бы склеивают клетки между собой, образуя межклеточные пластинки. Они находятся в значительном количестве в некоторых органах растений, например, в листьях, в мякоти плодов, ягод, корнеплодов, в кожице цитрусовых и во многих других.

Пектиновые вещества в природе минерализуются микроорганизмами, обладающими ферментами протопектиназой (пектазой) и полигалактуроновой (пектиназой). Фермент протопектиназа расщепляет в пектине связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанным с ней арабаном. Освободившаяся при этом метоксилированная полигалактуроновая кислота (растворимый пектин) под действием пектинэстеразы гидролизуется с образованием метилового спирта и полигалактуроновой кислоты.

Полигалактуроновая кислота подвергается также действию другого фермента - полигалактуроназы микроорганизмов (бактерий и плесневых грибов). Этот фермент гидролизует гликозидные связи между остатками галактуроновой кислоты, не содержащими метоксильных групп. Галактуроновые кислоты наряду с другими соединениями гидролизуются и используются микроорганизмами в качестве источника углерода. В результате гидролиза пектина образуются продукты: галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, ксилоза, уксусная кислота и метиловый спирт. Некоторые из них – моносахариды – используются этими же пектинразлагающими микроорганизмами, так арабиноза сбраживается ими до масляной кислоты и углекислоты, а из галактозы наряду с масляной и угольной кислотами выделяется водород (Емцев, Мишустин, 2006).

Среди пектинразлагающих микроорганизмов известны бактерии вида Clostridium pectinovorum, которые вызывают маслянокислое брожение пектиновых веществ (описаны Бейеринком в 1902 г.). Они представляют собой сравнительно крупные, подвижные, грамположительные палочки длиной 10-15 мкм и шириной 0,8 мкм. В клетках образуются споры, которые располагаются на утолщенных концах. Относятся эти бактерии к облигатным анаэробам. При сбраживании пектиновых веществ они накапливают масляную и уксусную кислоты, водород и углекислый газ. При соответствующих условиях брожения могут вырабатывать, кроме основных продуктов брожения, бутиловый спирт и ацетон.

Возбудителем пектинового брожения является также Clostridium felsineum. Микроорганизм выделен итальянским исследователем Карбонэ в 1916 г. из стеблей конопли. По форме клеток – споровая палочка одиночная или соединенная в короткие цепочки размерами 3/ 5 * 0,3 мкм. Споры располагаются на конце (барабанная палочка), но иногда бывают и в центре клетки. Культура обладает сравнительно высоким температурным оптимумом. Она сбраживает пектиновые вещества с образованием преимущественно уксусной кислоты и совершенно не продуцирует масляной.

Кроме описанных представителей, известны еще и некоторые другие, которые, разлагая пектиновые вещества, сбраживают продукты гидролиза (арабинозу, галактозу и др.) по типу маслянокислого или ацетонобутилового брожения.

Брожение пектиновых веществ нашло применение в хозяйственно-технической деятельности человека, в частности, для получения прядильных волокон из льна, конопли и других волокнистых растений путем мочки их в естественных водоемах.

Для ускорения и улучшения процесса освобождения волокон мочку сырья производят в бассейнах. При этом способе применяют специально выращенные культуры бактерий. Процесс ведут при температуре 26-28^оС в течение 5 суток вместо 1,5-2 недель в естественных водоемах.

Анаэробные бактерии рода Clostridium были открыты Л. Пастером в 1861 г. Ученый обнаружил, что некоторые представители данного рода сбраживают углеводы с образованием масляной кислоты. Сейчас среди представителей Clostridium насчитывается более 80 видов бактерий. Они имеют палочковидные клетки, обычно подвижны, передвигаются при помощи перитрихальных жгутиков. У видов рода образуются споры, имеющие овальную или сферическую форму; они терморезистентны. Как правило, споры раздувают клетку. Грамположительные. Облигатные анаэробы (Богданов и др., 1968).

Род включает психрофильные, мезофильные и термофильные виды. Температурный оптимум для роста большинства мезофильных видов лежит в диапазоне 30-40^оС. Для термофильных видов температурный оптимум составляет 60-75^оС. Оптимальная реакция среды для клостридий - нейтральная или слабощелочная. Хемоорганогетеротрофы. Клостридии сбраживают сахара, многоатомные спирты, аминокислоты, пурины и пиримидины, другие органические соединения. Ряд видов способен к фиксации молекулярного азота атмосферы. Места обитания клостридий - почва, водоемы, а также пищеварительный тракт человека и животных.

Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения.

Первая группа - сахаролитические виды Clostridium, сбраживающие главным образом растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО₂ и Н₂. Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие маслянокислое и ацетонобутиловое брожения: C.butyricum, C. pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. butylicum, C acetobutyricum и др. Возможно, к ней можно отнести и ряд видов – высокоспециализированных агентов анаэробного разрушения целлюлозы, причем главные конечные продукты брожения - этанол, ацетат и сукцинат, СО₂ и Н₂.

Вторая группа - протеолитические виды, сбраживающие аминокислоты. Обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов в средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО₂, Н₂, жирных кислот, и большого количества летучих соединений с неприятным запахом. К группе относятся виды: C. sporogenes, C. perfringens, C. histoliticum, C. botulinum и др. Многие представители рода Clostridium, сбраживающие аминокислоты, способны также к сбраживанию углеводов.

Третья группа - виды сбраживающие азотсодержащие циклические соединения - пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием C. acidi- urici, C. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО₂. C. uracilicum, C. oroticum сбраживают пиримидины, при этом урацил распадается до в- аланина, СО₂ и NН₃, а оротовая кислота- до уксусной кислоты, СО₂ и NН₃.

Четвертая группа включает всего один вид - C. kluyveri, сбраживающий смесь этанола с ацетатом до бутирата и капроновой кислоты, а также небольшого количества водорода.

Получение витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В₁₂ используют следующие микроорганизмы Prop. freudenreichii ATCC 6207, Prop. shermanii ATCC 13673, Prop. shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют разложение клетчатки.

1.3 Распространение маслянокислых бактерий

Наиболее распространенным углеродным соединением в природе является целлюлоза. Целлюлоза составляет от 15 до 60% массы растений, в хлопке и льне ее содержание достигает 80-95%.

Разложение целлюлозы микроорганизмами является самым большим по масштабам естественным деструкционным процессом, звеном круговорота углерода, обеспечивающего возврат фиксированного в процессе фотосинтеза углерода в атмосферу в виде СО₂.

Глобальная роль микроорганизмов в этом процессе определяется тем, что ни животные, ни растения, как правило, не способны разлагать целлюлозу. Трансформация целлюлозоразрушающих соединений в природе происходит в разных условиях аэрации, температуры, рН среды.

В природе разложение целлюлозы - это сложный, комплексный процесс, происходящий при участии сообщества микроорганизмов, в состав которого входят микроорганизмы, разлагающие целлюлозу, и микроорганизмы-спутники, использующие продукты распада.

В анаэробных условиях разложение целлюлозы осуществляется анаэробными бактериями рода Clostridium. При этом образуется много органических кислот (уксусная, янтарная, молочная, муравьиная) этиловый спирт, углекислый газ и водород.

В отличие от анаэробного разложения целлюлозы, который осуществляется только бактериями, в аэробных условиях клетчатку разлагают многие микроорганизмы разных систематических групп: бактерии, миксобактерии, актиномицеты, грибы.

В кислых лесных почвах главная роль в превращении целлюлозы принадлежит грибам (р. Trichoderma, р. Aspergillus, р. Penicillium и др., базидиальные грибы).

В почвах под травянистой растительностью, в степных и луговых ландшафтах в разложении целлюлозы помимо грибов участвуют миксобактерии, актиномицеты, вибрионы р.Cellvibrio.

Разложение целлюлозы до глюкозы микробными ферментами протекает в несколько стадий и требует участие сложного ферментного комплекса, включающего не менее четырех ферментов.

В анаэробных условиях глюкоза сбраживается в основном по типу маслянокислого брожения. В аэробных условиях глюкоза окисляется микроорганизмами до оксикислот, а затее до конечных продуктов - углекислого газа и воды.

Этот фермент гидролизует гликозидные связи между остатками галактуроновой кислоты, не содержащими метоксильных групп. Галактуроновые кислоты наряду с другими соединениями гидролизуются и используются микроорганизмами в качестве источника углерода. В результате гидролиза пектина образуются продукты: галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, ксилоза, уксусная кислота и метиловый спирт. Некоторые из них – моносахариды – используются этими же пектинразлагающими микроорганизмами, так арабиноза сбраживается ими до масляной кислоты и углекислоты, а из галактозы наряду с масляной и угольной кислотами выделяется водород (Емцев, Мишустин, 2006).

Получение витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В₁₂ используют следующие микроорганизмы Prop. freudenreichii ATCC 6207, Prop. shermanii ATCC 13673, Prop. shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламина в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную мелассу (10-100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10-100 мг/л), источники азота [(Nl-UhSCU]. В среду добавляют кукурузный экстракт (30-70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии культивируют при 30^о, поддерживая рН на уровне 6,5-7,0 путем введения (NH₄)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N₂ и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м³/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В₁₂ сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

1) выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;

2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;

3) дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80^о-120^оС в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO₂ или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, А1₂О₃, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом.

При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Выход витамина B₁₂ при использовании пропионовокислых бактерий - 25-40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 (Емцев, Мишустин, 2006).

Глава 2