Наночастицы металлов в растворах - биохимический синтез, свойства и применение, страница 2

Публикации По материалам работы имеется 53 публикации, из них 2 обзора, 19 статей, 4 патента и 28 тезисов докладов.

Работа выполнена при участии МГУ им. М.В.Ломоносова (кафедра химической кинетики и катализа химического факультета), Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Москва), НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГНЦ (Москва), Тамбовского государственного технического университета (кафедра химической технологии органических веществ), Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва).

Работа проводилась при поддержке РФФИ (грант 01-03-32783), комплексной программы РАН «Наноматериалы и супрамолекулярные системы» на 2003 г., ФЦП на 2009-2013 годы по лоту «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области биомедицинских и ветеринарных технологий жизнеобеспечения и защиты человека и животных», по теме «Инновационные технологии получения новых биологически активных субстанций с повышенной эффективностью терапевтического и диагностического действия и наноразмерных лекарственных форм созданных субстанций и известных медицинских препаратов», а также нескольких частных компаний, заинтересованных во внедрении наночастиц металлов.

Основное содержание работы

1. Биохимический синтез в обратных мицеллах.

   1. 1.1. Предпосылки метода. Сравнение с другими химическими методами.

Биохимический синтез относится к группе химических методов получения наночастиц металлов в растворах, основанных на восстановлении ионов металла до атомов в условиях, благоприятствующих формированию наночастиц. В этой группе синтез наночастиц проводится в молекулярных (водных или неводных) растворах или в обратных мицеллах – в тройной системе: водный раствор соли металла/ПАВ/неполярный растворитель. В последнем случае реакция восстановления и формирование наночастиц протекают в водном ядре мицеллы, образованной молекулами ПАВ (поверхностно-активного вещества). Восстановителями наиболее часто служат (1) неорганические (гидразин, борогидрид натрия) или органические (формальдегид, глюкоза, цитраты и др.) вещества, традиционно используемые в этом качестве в химии, (2) сольватированный электрон, генерируемый ионизирующим излучением, (3) фотоэлектроны, возникающие под действием УФ или лазерного излучения и (4) электроны, генерируемые на катоде в ходе электролиза растворов, содержащих соли соответствующих металлов. Во всех случаях используются стабилизаторы, которые обеспечивают устойчивость системы, предотвращая агрегацию наночастиц. Стабилизаторами обычно служат природные (желатин, крахмал, агар-агар и др.) или синтетические полимеры и ПАВ; в некоторых случаях роль стабилизатора может играть восстановитель.

Сравнительный анализ разных вариантов химического синтеза показывает, что система обратных мицелл имеет ряд преимуществ перед молекулярным раствором. Во-первых, агрегация наночастиц здесь происходит, как правило, значительно медленнее, то есть, время жизни наночастиц в обратно-мицеллярном (далее мицеллярном) растворе существенно увеличивается по сравнению с молекулярным раствором. Во-вторых, варьируя параметры мицеллярного раствора (в частности, задавая диаметр водного ядра мицеллы), оказывается возможным достаточно надежно контролировать размеры, получаемых наночастиц. Таким образом, синтез в обратных мицеллах позволяет получать дисперсии наночастиц со сравнительно узким распределением по размерам, что весьма существенно для исследования их свойств, в том числе «размерных эффектов».

Другой важный вывод вытекает из результатов применения не традиционных химических, а природных биологических восстановителей, содержащихся, главным образом, в водных экстрактах из растений или супернатантах культур бактерий. Было показано, в частности, что водные экстракты из семян люцерны, чечевицы, листьев хны и герани, почек и цветков гвоздики, из некоторых грибов, супернатанты культур кишечной палочки и золотистого стафилококка способны эффективно восстанавливать ионы благородных металлов (золота и серебра) в водном растворе с образованием наночастиц, стабилизированных либо самим восстановителем, либо другими веществами (белками, полисахаридами), присутствующими в том же растворе. Как неоднократно отмечалось в литературе, такой способ имеет ряд преимуществ перед традиционными методами, главными из которых являются мягкие условия синтеза и отсутствие в растворе, содержащем наночастицы, более или менее ядовитых побочных продуктов или примесей в самих наночастицах, которые неизбежно появляются при использовании основных химических восстановителей. Поэтому такое «биологическое» восстановление как основа для получения металлических наночастиц имеет хорошие перспективы применения в биологии, медицине и других областях, где важно обеспечить минимальную токсичность растворов наночастиц металлов для живых организмов.

В биохимическом синтезе сочетаются преимущества системы обратных мицелл и биологических восстановителей. В основе метода лежит восстановление ионов металлов в обратных мицеллах природными биологически активными веществами – растительными пигментами из группы флавоноидов. Используются три представителя этой группы- кверцетин, рутин и морин; первые два хорошо известны как вещества, обладающие выраженной антиоксидантной и радиопротекторной активностью и применяемые в медицине в качестве лекарственных средств и пищевых добавок. Изучение механизмов биологического действия флавоноидов (главным образом, путем изучения их реакций в водных растворах) позволило установить, что во многих случаях наблюдаемые эффекты обусловлены способностью этих веществ образовывать прочные комплексы с ионами металлов (главным образом, меди и железа), играющих важную роль в процессах перекисного окисления липидов. Наша идея состояла в том, что можно использовать эту способность флавоноидов для синтеза наночастиц металлов, если взаимодействие флавоноидов с ионами металлов будет происходить в водном ядре обратной мицеллы, то есть в среде, существенно отличающейся по свойствам от молекулярного раствора и, как известно из литературы, благоприятствующей образованию наночастиц в других вариантах химического синтеза. И действительно, реализация этой идеи позволила получить наночастицы золота, серебра, меди и других металлов.

Название «биохимический синтез» не вполне корректно, поскольку оно рождает аналогию с процессами биосинтеза, протекающими в живой клетке и являющимися одним из направлений исследований в биохимии, тогда как по существу речь идет о химической реакции восстановления ионов металла до атомов биологическими молекулами, которая запускает процесс агрегации атомов и ионов, то есть собственно синтез наночастиц. Аналогичная трудность возникает при формальном рассмотрении названий методов, использующих биологические восстановители («биовосстановление», «зеленый синтез», тот же «биохимический синтез»), о которых говорилось выше. В нашем случае из различных вариантов названия, обсуждавшихся на начальном этапе развития метода, со временем прочно утвердился лишь один - «биохимический синтез в обратных мицеллах» - поскольку в нем отражается основное отличие, с одной стороны, от химических методов, использующих небиологические восстановители в обратных мицеллах, и, с другой стороны, от химических методов, использующих биологические восстановители в водных растворах. В публикациях и докладах используется обычно сокращенный вариант – «биохимический синтез», с соответствующими пояснениями о сущности метода, если это оказывается необходимым.

По сравнению с другими химическими методами, биохимический синтез обладает рядом преимуществ, важных для практического применения металлических наночастиц. Сравнение с методами, использующими традиционные химические восстановители, выявляет следующие преимущества. Во-первых, при биохимическом синтезе образование наночастиц идет в растворе на воздухе, тогда как во многих других известных вариантах для получения наночастиц необходимо создавать вакуум или атмосферу инертного газа. Это обстоятельство, а также другие особенности процедуры синтеза позволяют избежать усложнений, необходимых в других методах (дополнительных синтезов, применения дорогостоящего или энергоемкого оборудования и др.), что значительно удешевляет конечный продукт. Во-вторых, оказывается возможным получать наночастицы, стабильные в растворе на воздухе в течение длительного времени (до нескольких лет), что весьма существенно как для исследования их свойств, так и для прикладных разработок. В то же время, известно, что в других случаях время жизни наночастиц часто не превышает нескольких дней. В-третьих, для некоторых металлов удается повысить степень превращения ионов металла в наночастицы по сравнению с достигаемой другими методами и уменьшить расход восстановителя, что важно, опять-таки, с экономической точки зрения. В-четвертых, применение природных восстановителей делает метод более экологически безопасным.

При биологическом восстановлении в водном растворе синтез также идет на воздухе, технологически не сложен, наночастицы в большинстве случаев стабильны в растворе на воздухе, раствор не содержит ядовитых примесей, так что здесь присутствуют почти все преимущества биохимического синтеза по сравнению с традиционными химическими методами, перечисленные выше. Однако имеются и проблемы, в силу которых этот способ получения наночастиц оказывается менее пригодным для практических целей, чем биохимический синтез. Во-первых, в большинстве случаев водный раствор, в котором образуются наночастицы, имеет сложный состав и неизвестно, какое вещество является восстановителем и в какой концентрации оно присутствует в растворе. Кроме того, состав раствора обычно плохо воспроизводим, поскольку он зависит от свойств биообъекта, которые, в свою очередь, могут существенно зависеть от его предыстории (например, для листьев растения – от условий (почвы, климата и т.д.), в которых оно выращено, фазы его развития, времени года). Во-вторых, для таких частиц характерно очень широкое распределение по размерам, что затрудняет исследования влияния размера частиц на их биологическую активность. В-третьих, скорость формирования и выход наночастиц часто бывают невелики, так что сложно быстро получить раствор с высокой концентрацией наночастиц, что требуется во многих вариантах применения.

1. В биохимическом синтезе эти недостатки отсутствуют, но это не означает, что метод является универсальным и может применяться без каких-либо ограничений. Например, наночастицы в обратных мицеллах (в мицеллярных растворах) взвешены в органическом растворителе, что делает невозможным применение их в водных средах. Но эта проблема была решена путем разработки технологии приготовления водных растворов наночастиц из их мицеллярных растворов (см. раздел 5). Таким образом, удалось сохранить преимущества биохимического синтеза в обратных мицеллах и в то же время расширить поле исследований свойств наночастиц и спектр возможных применений.

2. 1.2. Общая схема синтеза

Синтез проводится в обратных мицеллах из АОТ – анионного ПАВ, которое наиболее часто применяется для создания обратно-мицеллярных систем, поскольку оно хорошо растворимо во многих неполярных растворителях и позволяет получать стабильные обратные мицеллы в широком диапазоне концентраций ПАВ и степеней гидратации w = [H₂O]/[ПАВ]. Строение обратной мицеллы в системе Н₂О/АОТ/н-алкан в общем виде показано на рис.1. Для обычно используемой нами системы Н₂О/АОТ/изооктан во всем диапазоне степеней гидратации (0.5 <w ≤ 10) диаметр водного ядра, 2R_w ≤ 2 нм; при наиболее часто применяемых значениях (w < 4) 2R_w ≤ 1 нм.

Р ис.1. Строение обратной мицеллы. R_h и R_w - соответственно, гидродинамический радиус и радиус водного ядра. «Связанная» вода – жестко структурированная вода в пограничном слое, где сказывается организующее влияние полярных головок ПАВ. При малых степенях гидратации (w<4), наиболее часто используемых в биохимическом синтезе, вся вода в ядре мицеллы является связанной. Восстановление ионов металла в ядре мицеллы показано на примере иона Ag⁺.

О бщая схема биохимического синтеза показана на рис.2. Возможны два основных пути процесса: смешение предварительно отдельно приготовленных мицеллярных растворов флавоноида и соли металла (I) и введение водного раствора соли металла непосредственно в мицеллярный раствор флавоноида (II). В первом случае для приготовления мицеллярного раствора флавоноида используется его концентрированный раствор в этаноле или пропаноле. Во втором случае порошок флавоноида солюбилизируется в растворе АОТ/жидкий углеводород. В обоих случаях конечными продуктами являются наночастицы в водном ядре мицеллы и флавоноид в окисленной форме.

Рис.2. Общая схема биохимического синтеза. Fl и Fl⁺ - флавоноид в молекулярной и окисленной форме, соответственно. NP – наночастица.

Для каждого металла требовалась специальная работа по подбору условий (концентраций реагентов, концентрации АОТ, степени гидратации, состава соли металла), которые обеспечивали высокую скорость образования и стабильность наночастиц, а также достаточно высокую степень превращения ионов металла в наночастицы. По наблюдениям, сделанным на начальном этапе работ по биохимическому синтезу, при использовании варианта I скорость реакции и выход наночастиц, как правило, оказывались меньше, чем при выборе варианта II, поэтому в дальнейшем наночастицы получали почти исключительно по этому последнему варианту. Вследствие особенностей оптических свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов и металлических наночастиц, процесс формирования наночастиц сопровождается характерными изменениями окраски раствора, что часто позволяет визуально фиксировать момент начала синтеза и приблизительно оценивать скорость процесса.

1.3. Основные материалы и методы исследования

Для получения наночастиц использовали кверцетин (Qr), рутин (Ru) и морин (Mo) производства фирм Merck, Sigma-Aldrich или Acros, соли металлов (нитраты или сульфаты) марки х.ч. и золотохлористоводородную кислоту (ЗХВК), все отечественного производства, водный раствор аммиака, нормальные углеводороды (С₆ – С₈, чаще всего изооктан эталонный, Химмед), АОТ (бис-(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия) производства фирм Acros или Aldrich. Растворы солей металлов и ЗХВК готовили на деионизованной воде, полученной с помощью прибора «Водолей» (НПО “Химприбор”, Москва). Для приготовления водных дисперсий наночастиц использовали дистиллированную воду. Контроль рН и ионного состава воды проводили методом потенциометрии на приборе «Экотест-2000» («Эконикс», Москва). Растворы аммиачных солей металлов готовили путем введения водного раствора аммиака в водный раствор соли металла до полного растворения выпадающего осадка гидроокиси металла и образования комплексных аммиак-содержащих катионов серебра ([Ag(NH₃)₂]⁺), и других металлов ([Cu(NH₃)₄]²⁺, [Zn(NH₃)₄]²⁺ , [Cо(NH₃)₄]²⁺ ,[Ni(NH₃)₄]²⁺ ) Соответственно, получали растворы диамминнитрата серебра и тетраамминнитратов или тетраамминсульфатов двухвалентных металлов, которые затем вводили в мицеллярный раствор флавоноида до заданной степени гидратации. Мицеллярные растворы флавоноидов готовили по разработанной нами стандартной методике. Вначале готовили раствор АОТ в углеводороде, затем в нем солюбилизировали флавоноид, взятый в виде порошка. При необходимости АОТ и флавоноиды предварительно подвергали сушке для уменьшения содержания гидратационной воды. Концентрацию флавоноидов в растворе определяли методом спектрофотометрии; для этого предварительно находили их коэффициенты экстинкции в мицеллярном растворе.