Наночастицы металлов в растворах - биохимический синтез, свойства и применение, страница 8

К настоящему времени получены результаты исследований на нескольких биологических объектах – плазмодии низшего гриба Physarum polycephalum, одноклеточных водорослях Chlorella vulgaris, семенах растений, организме млекопитающих и культурированных клетках человека. Действие водных растворов наночастиц сравнивалось с действием растворов АОТ в тех же концентрациях, в которых этот ПАВ присутствует в растворе наночастиц, а также с действием ионов Ag⁺ , вводившихся в виде водных растворов нитрата серебра. Таким образом, оказывалось возможным (1) выделить биологический эффект наночастиц серебра в совокупном действии наночастиц и АОТ и (2) выяснить, является ли эффект наночастиц следствием действия ионов серебра, что важно для выяснения механизма действия наночастиц. Ниже приведено несколько примеров полученных результатов.

Плазмодий слизевого гриба Physarum Polycephalum

Исследования проводились совместно с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Плазмодий Physarum polycephalum является удобным тест-объектом для изучения явлений хемотаксиса – двигательной реакции клеток на неблагоприятные химические воздействия из окружающей среды. Он представляет собой многоядерную протоплазму, окруженную общей мембраной и обладающую способностью к неограниченному росту и амебоидному движению. В экспериментах определялось действие наночастиц на двигательную активность и рост плазмодия. Сравнивалось угнетающее действие (характеризующее степень токсичности) водных растворов наночастиц Ag, АОТ и ионов Ag⁺; эксперименты проводились в водных растворах (уровень двигательной активности тяжа плазмодия), а также на чашках Петри и на пластинках с питательной средой (рост плазмодия).

В нескольких сериях экспериментов с наночастицами диаметром 8-10 (± 4-6) нм на чашках Петри было показано, что, во-первых, наночастицы Ag в концентрациях ≥ 10^-4 M (10.8 мкг/мл) вызывают быструю гибель плазмодия и, во-вторых, при концентрациях, не вызывающих гибели плазмодия (≤ 10^-5 M или 1.08 мкг/мл) наночастицы более токсичны, чем AOT, ионы Ag⁺ или смесь AOT + Ag⁺ в концентрациях, равных тем, которые вводятся с водным раствором наночастиц. Пример показан на рис.30.

Рис. 30. Распространение плазмодия на агаровой подложке в контроле и в присутствии НЧС, AgNO₃ и АОТ. Верхний ряд: AgNO₃ – 10^-5 М, АОТ – 2.5 * 10^-3 %, НЧС – 10^-5 М. Нижний ряд: AgNO₃ – 10^-4 М, АОТ – 2.5 * 10^-2 %, НЧС – 10^-4 М. Время – 6 час после помещения на подложку стандартных образцов плазмодия. Масштабный отрезок – 1 см.

Видно, что при концентрации наночастиц C(НЧС) = 10^-4 M во всех случаях рост плазмодия не происходит, а при C(НЧС) = 10^-5 M наблюдается заметное различие в росте плазмодия на среде, содержащей наночастицы, и на трех средах, содержащих нитрат серебра, АОТ и их смесь в соответствующих концентрациях. Ясно также, что «чистый» контроль без всяких добавок неотличим от варианта с AgNO₃, и лишь незначительно отличается от двух других случаев, содержащих АОТ. Этот результат подтверждает вывод, сделанный нами ранее в исследованиях на бактериях кишечной палочки, о большей эффективности наночастиц по сравнению с ионами Ag⁺ в тех же концентрациях. Такой же вывод был сделан другими авторами в исследованиях на бактериях, животных клетках и эмбрионах рыб.

Данные, полученные в исследованиях уровня двигательной активности плазмодия в водном растворе и роста на питательной среде позволили построить следующий ряд сравнительной эффективности: AgNO₃ << AOT< AgNO₃ +AOT << наночастицы Ag. Таким образом, исследование хемотаксиса на плазмодии показало, что в случае наночастиц токсическое действие серебра многократно усилено, причем эффект усиления не сводится к дестабилизирующему действию на клеточную мембрану поверхностно-активного вещества (АОТ), образующего оболочку мицеллы. Кроме того, более высокая эффективность наночастиц по сравнению с ионами серебра позволяет предположить, что биологическое действие наночастиц не сводится к действию ионов серебра, но может включать иной механизм, в котором важную роль играют сами наночастицы металла.

Проводились также эксперименты с водными растворами наночастиц разного размера с узким распределением: 5.5±2.0 нм и 9.2±2.7 нм. Было обнаружено, что, при одинаковой общей концентрации наночастиц серебра в питательной среде, отрицательная реакция плазмодия более сильно выражена для наночастиц меньшего размера. Результат иллюстрируется рис.31. Зародыш плазмодия помещали на границе между двумя

полосками агара (разделенными промежутком 1 мм), содержащими наночастицы разного размера.

Рис.31. Реакция плазмодия на присутствие наночастиц серебра разного размера

Видно, что рост плазмодия происходит почти исключительно в сторону среды с наночастицами большего размера (SNP5), то есть наблюдается явное «избегание» наночастиц меньшего размера (SNP4). Это подтверждает имеющиеся в литературе данные о большей токсичности наночастиц серебра малого размера. Возможно, влияние размера связано с различием в числе наночастиц на единицу объема среды. В нашем случае это число различается примерно на порядок: SNP4 - 1.48 x 10¹⁴; SNP5- 3.16 x 10¹³ (частиц/мл).

В целом полученные здесь результаты позволяют заключить, что хемотаксис является чрезвычайно чувствительным тестом в исследованиях токсичности наночастиц. Данные, полученные на плазмодии Physarum polycephalum, позволяют рекомендовать подобные тесты для выявления следовых количеств вредных веществ на любых про- или эукариотических клетках, способных к хемотаксису.

Одноклеточная водоросль Chlorella vulgaris

Токсичность наночастиц Ag исследовалась на живых клетках культуры микроводоросли методом микроэлектрофореза на приборном комплексе «Цито-эксперт», в сотрудничестве с Инженерно-техническим центром (лабораторией биотестирования, г.Ижевск). Токсичность наночастиц оценивалась по изменению амплитуды колебаний клеток в переменном электрическом поле, обусловленному уменьшением их поверхностного заряда, который является показателем жизнеспособности клеток. Клетки водоросли в дистиллированной воде инкубировали с наночастицами при различных концентрациях в интервале 10^-8 – 10^-4 M (0.00108 – 10.8 мкгAg/мл) заданное время, затем определяли индекс токсичности T = (A_c – A_cell)/A_c , где A_c and A_cell – средние амплитуды колебаний, найденные для контрольной (клетки без наночастиц) и экспериментальной суспензии, соответственно. Независимо определялась токсичность ионов Ag⁺ и смеси Ag⁺ +АОТ в соответствующих концентрациях, аналогично тому, как описано выше в экспериментах с плазмодием. Результат показан на рис. 32.

Рис.32. Токсичность наночастиц (AgNP), AgNO₃ и смеси AOT + AgNO₃ для клеток водоросли Chlorella vulgaris.

Токсичность наночастиц вначале возрастает с увеличением их концентрации, затем остается постоянной в интервале 0.108 мкг/мл (10^-6 M) - 10.8 мкг/мл; достигнутый уровень токсичности равен примерно ½ максимального (Т=1). Почти при всех исследованных концентрациях (кроме 10^-4 M) наночастицы Ag более токсичны, чем ионы Ag⁺ или Ag⁺ + AOT при тех же концентрациях, что и введенные с наночастицами, в согласии с данными, полученными на плазмодии. Таким образом, и в этом случае действие наночастиц не сводится к действию ионов серебра. Одинаковая токсичность всех трех агентов при наибольшей концентрации (10^-4 М) объясняется, скорее всего, тем, что клетки уже нежизнеспособны, подобно тому, что наблюдалось при этой концентрации на плазмодии.

Семена растений

Исследовалось действие наночастиц Ag на всхожесть семян арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) и сои (Glycine max); данные получены в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Оба растения являются известными тест-объектами для изучения влияния различных факторов на генетические характеристики растительных организмов. Сравнивалось влияние водного раствора наночастиц размером 9±6 нм и растворов АОТ в соответствующих концентрациях. Концентрация наночастиц и АОТ в исходном растворе составляла 5*10^-3 М и 15*10^-3 М, соответственно. Семена предварительно замачивали в дистиллированной воде в течение 24-х часов, затем заливали растворами наночастиц или АОТ и инкубировали еще 24 часа, затем отмывали дистиллятом и ставили на проращивание в стандартных условиях. Оказалось, что присутствие АОТ практически не влияло на всхожесть семян, то есть цитолитический эффект отсутствовал. В случае наночастиц снижение всхожести наблюдалось при концентрациях выше 1*10^-3 М (108 мкг/мл), а при более низких концентрациях эффект отсутствовал. Результат эксперимента с семенами арабидопсиса показан на рис.32.

Рис. 32. Всхожесть семян Arabidopsis thaliana при действии наночастиц серебра (НЧС) и АОТ.

Из полученных данных вытекает, что при наиболее высоких концентрациях в исследованном диапазоне водная дисперсия наночастиц серебра более токсична, чем раствор АОТ, что согласуется с рядом токсичности, найденным для плазмодия. Другое следствие состоит в том, что для исследованных семян в широком диапазоне концентраций (5*10^-7 - 1*10^-3 М) водный раствор наночастиц серебра не токсичен, что указывает на возможность его использования для обработки семян с целью защиты их от поражения патогенными бактериями. В отличие от результатов, полученных на бактериях E.coli, плазмодии и клетках хлореллы, для семян обнаружено сильное цитотоксическое действие ионов Ag⁺, причины которого пока не выяснены.

Организм млекопитающих

И сследовалось действие водных растворов наночастиц Ag на длительность жизни мышей линии BALB в возрасте 3-4 мес. (данные Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН). В задачу исследования входило:1) определение процента выживаемости мышей в зависимости от концентрации введенного раствора наночастиц серебра (НЧС) и 2) установление дозы раствора, вызывающей 50% гибели животных в течение 30 дней после введения (ЛД50/30). Работа проводилась с тем же раствором наночастиц, что и в опытах на семенах растений. Раствор наночастиц (0.2 мл) вводился однократно внутрибрюшинно в различных разведениях; минимальная концентрация наночастиц составляла 0,05*10^-3 М. Действие наночастиц сравнивалось с действием растворов АОТ и нитрата серебра в эквивалентных концентрациях. Определение выживаемости проводилось по стандартной методике в течение 30-ти дней после введения растворов. Результаты показаны на рис.33.

Рис. 33. Смертность мышей при инъекции препарата НЧС и раствора АОТ в зависимости концентрации.

Из анализа полученных данных вытекает, что процент гибели был выше в группе с введением наночастиц серебра, чем при введении АОТ. На основании регрессионного анализа данных по выживаемости была определена доза раствора, вызывающая 50% гибели животных. Величина ЛД50/30 составила для наночастиц Ag (2, 75 ±0,66)10^-3 М, а для АОТ – (32,6±17,1) *10^-3 М. Полученные результаты указывают на достаточно сильный и зависимый от концентрации наночастиц летальный эффект при инъекции у мышей, независимо от пола животных. Существенное различие в величинах ЛД50/30 для наночастиц и АОТ свидетельствует также о меньшей токсичности ПАВ по сравнению с раствором наночастиц, в согласии с выводами, сделанными в ходе исследований плазмодия и семян растений. Введение раствора нитрата серебра не вызывало гибели мышей при всех исследованных концентрациях, что указывает на существенно меньшую токсичность ионов, чем наночастиц серебра, а также на то, что токсическое действие наночастиц не сводится к действию ионов серебра.

Культуры клеток человека

Исследовали действие водных растворов наночастиц Ag на культуры клеток опухолей человека (линии HeLa и U937). Работа проводилась в НИИОПП РАМН с целью получения сведений о механизме действия наночастиц металлов на клетки человека, а также для выяснения возможности использования наночастиц серебра в качестве лекарственного средства в терапии онкологических заболеваний. Клетки снимали с матрасов в логарифмической фазе роста стандартным образом и переносили в 96 луночные планшеты. Через сутки к клеткам добавляли водный раствор наночастиц в разных концентрациях или контрольные растворы (Ag⁺ , АОТ или смеси Ag⁺ + АОТ), инкубировали в стандартных условиях роста культур заданное время, после чего клетки отмывали и определяли цитотоксичность исследуемых агентов двумя способами – по уровню функциональной активности митохондрий (МТТ-тест) и внутриклеточных ферментов (ФДА/ПИ –тест). Определялась также возможность переноса наночастиц через клеточную мембрану путем эндоцитоза посредством блокирования активного транспорта (инкубация клеток при 4^оС). Было обнаружено, что для обоих типов клеток токсичность наночастиц выше, чем соответствующих концентраций АОТ, ионов Ag⁺ и смеси Ag⁺ + АОТ, что может говорить о наличии специфической составляющей в действии наночастиц, в согласии с выводами, сделанными на других исследованных объектах.