Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 222
Текст из файла (страница 222)
Линии клеток пнх' можно отнести к двум классам, отличающимся своим ответом на отсутствие метотрексата в среде, когда потребность в высоких уровнях активности ТЗНРВ снимается. В стабильных линиях амплифицированные гены сохраняются. В нестабильных линиях амплифицированные гены по крайней мере частично утрачиваются при снятии селектнвного давления. Причиной таких различий, несомненно, служат условия, в которых находятся в них амплифицированные гены 4)(/г (рис. 38.9). В стабильной линии клеток яах' амплифицированные гены являются хромосомными и занимают обычный сайт 4)4г на одной из хромосом.
Как правило, другая хромосома сохраняет свою единственную копию Йгг. Таким образом, амплификация происходит толъко в одном из двух аллелей ИЙГг и возросшая устойчивость к метотрексату сопровождается дальнейшим увеличением степени амплификации этого покуса. (Однако иногда хромосома с амплифицированным покусом Ы)цг сама дуплицируется, по-видимому, в резуль~ате нерасхождения при митозе.) Амплификация гена оказывает видимый эффект на хромосому; покус можно идентифицировать визуально как гомогенно окрашенную область (НЯВ).
Это показано на рис. 38.10. НБВ получила свое название из-за присутствия дополнительной области, в которой хромосомные полосы при соответствующих обработках, например при С-окрашивании, выявить не удается (см. рис. 28.9). Это позволяет предподагать, что определенная область между полосами расширилась. В тех хромосомах нестабильных клеточных линий, которые несут ген Ж9г, изменений не обнаружено. Однако в этом случае установлено появление большого числа элементов, названных двойными микрпхрпмоепмами, Такие хромосомы видны на рис.
38Л1. В ~ипичной клеточной линии каждая двойная микрохромосома несет 2 — 4 гена 4)1)г. Двойные микрохромосомы, по-видимому, представляют собой самореплицирующиеся структуры, утратившие центромеры, В результате они не способны прикрепляться к митотическому веретену, сегрегируют нерегулярно и поэтому часто утрачиваются дочерними клетками. Несмотря на данное им название, в действительности двойные микрохромосомы представляют собой внехромосомные элементы, Нерегулярное наследование двойных микрохромосом объясняет нестабильность признака резистентности к метотрексату в этих линиях. Двойные мнкрохромосомы непрерывно утрачиваются во время клеточных делений; в присутствии же метотрексата клетки с уменьшенным числом генов в)(г погибают.
В популяции выживших клеток сохраняются только те клетки, которые сохранили Часть Х. Динамичность генома: постоянное изменение ДНК 498 Стейнльнеи линни Исходнаи линия Нестабильная линия Эффект селектнвнмх условий С;:Х:::;;Э Хромосома с одним геном дыг С Л.......Э Хромосома с амплифицирован- ными генами сатг Внехромосомная покалнаация )двойные микрохромосомы) с амплифицировеннмми генами саф Рис. 389 Гон с)т)г может быль аыцлифицяровцв, в результате чего обраэуютса дополнительные копии, которые могут быть вксхромосомныыи (нестабильными) ялн хромосомныыи 1ста- бильныма).
достаточное количество двойных микрохромосом. Присутствие этих структур уменьшает скорость деления клеток. В результате при снятии селективного давления клетки, утратившие амплифицнрованные гены, имеют селективное преимущество: они быстрее образуют потомство и вскоре оказываются в популяции в большинстве. Именно этим можно объяснить, почему амплифицированное состояние сохраняется, только пока клетки растут в присутствии метотрексата.
Продолжительная селекция на устойчивость к метотрексату позволила выделить как стабильные, так и нестабильные по этому признаку линии клеток. Какова первоначальная ступень в амплификации гена? На первых ступенях отбора большинство или все резистентные клетки проявляют нестабильность. Образование внехромосомных копий явно представляет собой более частое событие, чем амплификация внутри хромосомы. Мы не знаем, происходит ли внутрихромосомная амплификацня менее часто как процесс, происходящий г)е посо, нли она связана с внехромосомной амплификацией, являющейся промежуточной ступенью процесса.
Из-за неправильной сет регацин двойных микрохромосом увеличение числа копий может происходить относительно быстро в тех случаях, когда при каждом делении отбираются клетки, содержащие больше, чем положено, копий генов сУ11'и. Такис клетки возникают и отбираются в ответ на возросшие уровни метотрексата. Поведение двойных мнкрохромосом объясняет ступенчатую эволюцию признака ртгхг и нерегулярные колебания в уровне генов в нестабильных линиях. Каким образом возникают внехромосомные копии? Мы знаем, что нх образование не связано с утратой исходной копии хромосомы. Одна из возможностей представлена на рнс. 38.12.
Показано, что вблизи генов Л)уг иницинруются дополнительные циклы репликации. Благодаря какому-то рекомбинационному событию из хромосомы высвобождаются внехромосомные копии. В зависимости от природы такого события может образовываться внехромосомная молекула ДНК, содержащая одну или несколько копий. Если двойные микрохромосомы содержат кольцевые ДНК, рекомбинация между ними в любом случае будет приводить к образованию мульти- мерных молекул. Происхождение амплифицированных хромосомных копий объяснить значительно сложнее. НЖ состоит из большого числа тандемно повторенных единиц. Одна из трудностей в объяснении их возникновения путем интеграции последовательностей двойных микрохромосом связана с тем, что число хромосомных повторов во много раз больше, чем число повторов в отдельных двойных микрохромосомах.
Большое число интегрированных копий является также препятствием при создании моделей для строго внутрихромосомного события амплификации. Амплифицнрующаяся область значительно протяженнее, чем сам ген йт)г. Ген имеет длину, равную примерно 31 т.п.н., в то время как средняя длина повторяющейся единицы составляет 5.10'-1 10 нар оснований в хромосомной области НЯК. Протяженность ДНК двойных микрохромосом, по-видимому, колеблешься в пределах от 1 Гба до 1 1Ос пар оснований. Хромосомная область, дающая начало амплифицированным генам, может со- 499 38.
Элементы, способные к перемещению Соариеаиие кониос реоиииираеа нос обнаски Вмреаа ни ооон Л натер сст Рпс 38.!О. Амплнфнцированные копии гена йф образуют го- могенно окрашнвающуюся область (Нбй) в хромосоме. ответствовать репликону, в котором она локализована. Амплификация происходит и в отсутствие метотрексата, однако, если нет какого-либо селективного давления, клеточная популяция утрачивает ее продукты. Почему такое явление характерно лишь для нескольких генов? Возможно, амплификация затрагивает гены, расположенные в соответствующих участках репликона, или происходит в тех случаях, когда в этих участках находятся соответствующие повторяющиеся последовательности, позволяющие этой области выщепляться с помощью рекомбинации. Некоторая информация о событиях, вовлекаемых в процесс сохранения двойных микрохромосом, получена благодаря изучению нестабильных клеточных линий, в которых амплифицированпые гены кодируют мутантный фермент РНГК.
Мутантный фермент не присутствует в исходной ~диплоидной) линии клеток; следовательно, мутация доджна была возникнуть в какой-то момент процесса амплификации. Несмотря на вариации в числе ампдифицированных генов, эти клетки обладают только мутантным ферментом. Следоватедьно, хромо- Рнс 33.! 1, Ампляфнцнрованные нисхромосомные гены Лф.
приобретают форму двойных микрохромосом, которые видны в виде мелких белых точек. Фотография любезно преластаилена Р Шимке сомные гены дикого типа не могут служить постоянным источником больших кодичеств новых двойных микро- хромосом, так как их амплифицированные копии образовывали бы нормальный фермент. Следовательно, изменения в состоянии клетки осуществляются благодаря однажды возникшим амплифицированным внехромосомным генам, а не благодаря исходным хромосомным копиям этих генов.
При удалении метотрексата клеточная линия утрачивает свои двойные микрохромосомы. При повторной обработке реагентом нормальные гены амплифицируются, давая новую попу- Рис. ЗХ.!2. Внсхромосомные копии ДНК могли Возникать пу- тем ренннцинцни реплнкацнн, сопровождаемой нсзомолсгнчиой рекомбинацней между репликами. Часть Х. Динамичность генома: постоянное изменение ДНК ляцию двойных микрохромосом.
Следовательно, ни одна из внехромосомных копий мутантного гена не встраивается в хромосому. Другой важный вывод, следующий из этих результатов, сводится к тому, что двойные микрохромосомы мутантной линии несут только мутантные гены, так что в случае наличия в двойных микрохромосомах более одного гена Ж))г все они должны быть мутант- ного типа. Это показывает, что мультикопийные двойные микрохромосомы могут образовываться из отдельных внехромосомных генов. ВВЕДЕНИЕ ЗКЗО1ЕННЫХ последовательностей посредством трансфекции Эксперименты с трансфекцией были начаты с добавления препаратов метафазных хромосом к суспензиям клеток. Хромосомы включались клетками довольно неэффективно, и с низкой частотой возникали нестабильные варианты.
Интактные хромосомы редко сохранялись во время процедуры; реципнентные клетки обычно приобретали фрагмент донорной хромосомы (который отличался нестабильностью из-за отсутствия центромеры). В редких случаях возникали стабильные линии в результате интеграции материала донора с хромосомой хозяина. Такие же результаты получены прн добавлении к реципиентным клеткам очищенной ДНК. В этом случае оказалось возможным добавлять определенные последовательности, а не полагаться на случайную фрагментацию хромосом. В результате трансфекции с помощью ДНК получают как стабильные, так и нестабильные линии. Эти эксперименты аналогичны бактериальной трансформации, однако их называют трансфекцией, поскольку исторически термин «трансформация» используют прн описании изменений, позволяющих эукарнотнческим клеткам неограниченно размножаться.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
