Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 223
Текст из файла (страница 223)
Низкая частота трансфекции делает необходимым использование донорных маркеров, присутствие которых в рецициентных клетках способствует отбору. Следует отметить, что трансфнцированные последовательности экспресснруются. В большинстве экспериментов по трансфекции использовали маркеры, связанные с легко определяемыми ферментатнвнымн функциями; но в принципе может быть использован любой селектируемый маркер.
Это позволяет выделить гены, ответственные за морфологические изменения. Например, могут быть отобраны трансфицнрованные клетки, которые приобрели трансформированный фенотнп (способность неограниченно размножаться с образованием опухоли). Затем можно идентифицировать последовательность ДНК, ответственную за изменение фенотипа. Таким способом были выделены некоторые клеточные овс-гены. Котрансфекцня двух и более маркеров дала дополнительные сведения о механизме трансфекции и расширила круг вопросов, которые могут быль решены с помощью этого метода.
В случае трансфекции клеток г)г препаратами ДНК, содержащими очищенный ген г)г+ и геном фХ174, все трансформанты содержат обе донорные последовательности. Это наблюдение оказалось полезным, поскольку позволило вводить неселективные маркеры посредством котрансфекцин с селектируемым маркером. Расположение последовательностей 1й и фХ174 различно в каждой трансфнцнрованной линии, но во время размножения одной линии оно сохраняется неизменным. Часто обнаруживается множество копий донорных последовательностей, причем число их в отдельных линиях варьирует. Ревертанты утрачивают последовательности фХ!74 вместе с последовательностями г)с Амплификация трансфицированных последовательностей в условиях селективного давления ведет к равному и одновременному увеличению числа копий всех донорных последовательностей. Следовательно, два типа донорных последовательностей оказываются во время трансфекции связанными физически и имеют общую судьбу.
В опытах по трансфекции массу добавленной к реципиентным клеткам ДНК обычно увеличивают за счет избытка ДНК-носителя, препарата какой-то другой ДНК (например, ДНК спермы лосося). Доказано, что трансфицируемые клетки получают ДНК-носнтель в виде последовательностей, фланкирующих селекгируемые с каждой стороны. Следовательно, трансфекция осуществляется структурой ДНК, состоящей из ряда сцепленных последовательностей всех типов, присутствующих в препарате донора. Поскольку ревертанты по селекгнруемому маркеру утрачивают весь этот материал, кажется вероятным, что трансфицируемые клетки приобретают только одну такую структуру ДНК, Данная структурная единица может образовываться благодаря конкатемерному сцеплению донорных последовательностей в ходе реакции, которая проходит очень быстро по сравнению с другими событиями, вовлекаемыми в процесс грансфекции. Такая трансфицируемая единица может иметь протяженность около 1 10 п.
н. Мы не можем установить с помощью метода гибридизации, сцеплена лн донорная единица с хромосомной ДНК реципиента (интересующие нас концевые фрагменты представлены в слишком незначительных количествах). Вероятно, что первая стадия процесса заключается в образования нестабильных внехромосомных единиц, которые впоследствии стабилизируются в результате интеграции.
В некоторых клеточных линиях методом гибридизации )п з)1н было показано, что трансфицированные клетки содержат донорный материал, интегрированный в хромосомы хозяина. Любая определенная клеточная линия имеет только один сайт интеграции; однако сайты в каждой линии различны. Вероятно, выбор сайта для инте| рации — случайное событие; иногда оно связано с большими хромосомными перестройками.
Некоторые интересные результаты, полученные прн котрансфекции двух селективных маркеров, суммированы нв рнс. 38ЛЗ. Линия реципиентных клеток АРйт ТК была трансфицирована с помощью ДНК, несупзей гены аргг и йс Ген аргг был представлен активным аллелем аргг~, кодирующим фермент аденозинфосфорибозилтрансферазу. Ген г)г представлял неактивный аллель, сохраняющий кодирующую область фермента тнмидннкиназы, но утративший промотор. Трансфицированные клетки отбирали, используя маркер аргг+, однако прн этом приобретались обе донорные последовательности. Затем клетки АРКТ+ ТК подвергали селекции по способности обеспечивать функцию ТК + . Осуществление этой функции зависело от двух событий.
ТК должен был транскрибироваться с какого-то сайта, замещающего его промотор; поскольку это обусловдивает только низкий уровень экспрессии, необходимо увеличение числа копий данного гена, т.е. его амплификация. Отобранные клетки имели фенотип АРКТ ТК+ и содержали около 40 копий трансфнцируемых единиц аргг-1)г, интегрированных в один хромосомный сайт. Наконец, 38. Элементы, способные к перемещению 50! Селекция цетт+- Селекция й к «леток Селекция артха клеток Плееми олилыи Рис. 38.13.
В случае амплифнкацвв трансфицированньы генов весь кластер коордииировавно реагирует на дальнейшее селек- тивиое давление. Рис. 38,14. С помощью травсфскцни можно вводить ДНК в клетки зародышевых линий животных. среди этих клеток отбирали клетки с фенотипом АРКТ Их появление связано с элиминацней экспрессии копий гена пргг т без повреждения экспрессии гена 1)т. Интересно, что все копии гена аргг в этик клетках приобретали одну и ту же негативную мутацию. Этот результат свидетельствует о существовании какого-то механизма, который позволяет всей группе генов быть регенерированной из одного гена или подвергаться коррекции в соответствии с последовательностью одного гена; повидимому, это происходит в течение одной клеточной генерации. Трансфицированная ДНК способна включаться в геном клеток зародышевой линии Метод трансфекции успешно применяется для введения генов в геном животных (рис.
Ж14). Плазмиды, несущие интересуюший исследователей ген, вводятся в зародышевый пузырек )ядро) ооцита мыши или в пронуклеус оплодотворенного яйца. Затем зто яйцо имплантируется самке. Таким образом, были введены гены глобина и гибридные гены, содержащие промотор для металлотионеина, который сцеплен с кодирующей последовательностью тимидинкиназы. Промотор МТ ведет происхождение от природного гена мыши; его присутствие можно определить по способности отвечать на обычную индукцию тяжелыми металлами или глюкокортикоидами (ответ определяют по активности тнмидинкиназы). В этих опытах ДНК плазмид ввели в 69 яиц. Десять из развившихся мышей несли ннъецированную последовательность, что было показано при анализе ДНК из клеток почек.
Обычно в один хромосомный сайт множество копий плазмнд внедрялось, по-видимому, тандемно. Число копий варьировало от 1 до ! 50. Они Часть Х. Динамичность генома: постоянное изменение ДНК 502 Глава 39 КАК ФОРМИРУЕТСЯ МНОГООБРАЗИЕ АНТИТЕЛ наследовались потомством инъецированной мыши, подобно тому как происходит наследование менделевского локуса. У семи мышей в почках и печени происходила экспрессия гена тимидинкиназы (ткани, в которых обычно ген МТ проявляет активность). Выражения не наблюдали в клетках мозга, ткани, в которой обычно ген не функционирует. Экспрессия индуцировалась при добавлении тяжелых металлов, но не глюкокортикоидов. В потомстве инъецированной мыши экспрессия донор- ного гена варьировала. Уровень экспрессии гена не коррелировал с числом тандемно интегрированных копий даже у исходных родителей.
Возможно, только некоторые из генов были активными. (Следует указать, что если бы были активными все дополнительные гены, вряд ли сохранялся бы нормальный регуляторный ответ, поскольку большое число промоторов способно связать большинство регуляторных молекул.) Чем вызваны вариации в экспрессии генов? Одно из объяснений, часто используемое для случаев трансфицированных генов и интегрированных геномов ретровирусов, связано с предполагаемой важной ролью сайта интеграции. Возможно, что ген выражается, если он интегрирован только в пределах активного домена. Другая возможность заключается в наличии эпигенетической модификации.
Некоторые из трансфицированных генов мышев оказались метилированными. (Так как донорная ДНК не несла метильные группы, это наблюдение позволяет предположить, что существует фермент, способный асуп!ествлять метилирование бе почо.) Изменения в способе метилирования генов могут обусловливать Иммунвый ответ млекопитающих проявляется в безграничном разнообразии антител, каждое из которых синтезируется в ответ на появление нового антнгеиа. Обычно антиген представляет собою белок (или связанную с белком субстанцию) чужеродного происхождения, который попадает в кровяное русло животного или человека.
Например, таким антигеном может быть белковая оболочка инфицирующего вируса. Появление антигена индуцирует образование антитела, специфически распознакпцего только данный антиген. Антитела синтезируются в В-лимфоцитах, и они (совместпо с другими белыми кровяными клетками. Т-лнмфоцитами и макрофагами) участвуют в удалении из организма антигена. Если в организме однажды уже синтезировались антитела на определенный антиген, то способность к производству данного антитела сохраняется, чтобы отражать дальнейшие повторные атаки уже знакомого антигена.
Одной из наиболее загадочных особенностей этого процесса является способность образовывать нужные антитела всякий раз при попадании в организм нового аптигена. Каким образом организм может быть подготовлен к производству анти~ел, каждое из которых предназначено специфически распознавать антиген с непредсказуемой структурой? изменение их активности. С другой стороны, тены, которые являются активными у родителей, могут быть делегированными нли амплифипированными у потомства. На примере этих экспериментов мы видим возможность расширения круга объектов для исследования регуляции от культивируемых клеток до животных.
Возможность введения ДНК в геном позвоночных позволяет нам производить в нем изменения, добавлять новые гены, способные нести определенные модификации, введенные в ДНК !и ч(гго, С помощью этого метода может оказаться возможным выявить причины ткапеспецифичной экспрессии генов. Вероятно, в конце концов станет реальностью и замена дефектных генов в генотипе. Рекомендуемая литература Природа ретровирусов подробно проанализирована в сб.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
