Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Через несколько минут после этого культуру разбавляли в несколько сот раз питательной средой для того, чтобы понизить концентрацию антител и предупредить инактивацию фагового потомства. Через определенные промежутки времени в пробах инфицированной культуры определяли концентрацию инфицирующих единиц, высевая на чашки с индикаторными бактериями и подсчитывая число стерильных пятен (негативных колоний) на тазоне.
Результаты графически представлены на рис. 7.1, А. В течение первых 24 мин после прикрепления фага к клетке число инфицирующих единиц в культуре оставачось постоянным. В этот период кажцая негативная колония образовывалась отдельной инфицированной клеткой, из которой по~омство фага выходило после того, как клетка оказывалась на поверхности агара. По прошествии этих 24 мин число инфицирующих единиц в культуре начинает й»10т »» я »,» О 'О й й ю' » й е Й я Б " 1о' м е ЦЯ1 е то я О,1 е "оо~ 0 10 20 ЗО 40 Время, ясмяшм с момента заражения, мяя Ряс.
7.1. Жизненный цикл фага Т4. А. Оли- иочиый цикл развития фзгя Т4. Б. Внутрикле- точное развитие фага Т4. [По А.Н. моегляятн, (1952). 1. Оеп. Рйузю!., 35, 645.1 Организация и передача генетического яштериала Головка р20, р21, р22, р23 р24, р31, р40, раа ф Хвостовой отросток Капсид НК ' ре,ра,рт,рв, ртп, р25, р25 ~ рг,рта,рг,р51,953 ре, ры, р12 р54 Шипы отростка Баэальнал рть пластинка Р 19 Стержень Коннектор Гпз ры ртв Щ Чехол— Фибриллы отростка Рис. 7.2.
К сборке фаговых частиц ведут четыре независимые цепи событий, сливаю- щиеся в самом конце этого процесса. Числа- ми указаны продукты фаговых генов, о ко- ~ рЗт,рзт чг Проксимальнал половина '~~~~ Дис тельная половина р35 торых известно, на каком именно этапе они функционируют. Г)Роод )т'.В. )1973). 1п: Оепет)с МесЬал)зглз оГ Пете!ортепг (Р.Н. Кидд1е, ед.), Асадет)с Ргезз, )Чек 'г'ог)с.) 7. Геном вируси расти, поскольку некоторые клетки лизируются и высвобождают содержащиеся в них фаги. К 30-й мин почти все инфицированные клетки уже разрушены.
Число инфицирующих единиц к концу эксперимента примерно в 100 раз превышает число инфицированных клеток. Из каждой клетки выходит около 100 потомков фага. Ясно, что существенные лля размножения фа!.а Т4 собьпия происходят в течение латентного периода (рис. 7.1, А), предшествующего высвобождению потомства из инфицированных клеток. Количество фаговых частиц внутри клеток можно определить, искусственно лизируя инфицированные клетки в различные моменты латентного периода. Результаты такой процедуры представлены графически на рис.
7,1, Б. Обратите внимание на то, что в первые 10-11 мин после адсорбции родительских фагов на бактериальной клетке инфицирующих единиц в клетках не обнаруживается вовсе. Этот промежуток называется скрытым периодом. Даже родительские фаги в зараженных клетках утрачивают инфицирующую способность. Ло прошествии 11 мин в некоторых клетках начинают появляться фаговые частицы, способные заражать бактериальные клетки, и к 14-й мин в каждой клетке содержится в среднем по одной фаговой частице. Затем число таких фагов внутри клеток быстро растет в оставшееся до конца латентного периода время и достигает насыщения в период лнзнса клеток.
Этот эксперимент показывает, что фаги не просто делятся, как это делают бактерии;механизм их размножения был раскрыт в эксперименте Херши---Чейза, описанном в гл. 4. Морфогенетические события, происходящие в скрытом периоде, были исследованы посредством наблюдения инфицированных клеток под электронным микроскопом и методами генетического анализа (рис. 7.2). На рисунке видно, что существуют четыре отдельные последовательности событий, которые все вместе приводят к сборке фага.
Во-первых, репликация родительской ДНК инфицировавшего клетку фага приводит к наработке пула ДНК фага Т4. Во-вторых, ДНК управляет синтезом многочисленных белков, необходимых для морфогенеза головки фага (капсида), хвостового отростка и его нитей (фибрилл). Синтез головки фага завершается упаковкой в нее молекулы ДНК. Затем к головке прикрепляется уже собранный отросток. И наконец, к отростку крепятся нити, и сборка фага завершена. Изображенная на рис.
7.2 детальная последовательность событий на каждом этапе была расшифрована посредством генетического анализа мутаций, влияющих на развитие фага Т4. В этой ~лаве мы расскажем о том, как генетический анализ помогает понять устройство и работу вирусного генома. Мутантные бактериофаги Как уже говорилось в предыдущей главе, лишь немногие фаговые гены имеют мутации, изменяющие морфологию негативнь2х колоний. С другой стороны, очевидно, что во всех существенных для размножения генах фага, могут происходить легальные мутации, делающие невозможным появление фигового потомства. Мутанты, не жизнеспособные 194 Организация и передачи генетического материала Тнблвип 7.1. Фенотнпы зиз-мутпнтон фага в бактериях с различными генотипами Генотип бактерии-хозяине' Генотип фага ~паиЬ г ~и оры ~Н а«в«а + Дикий тип Зигпаьаг З а«Ь« зт ры ' «М» посомсгво есзь, «-» потомстве иег.
в олних условиях и развиваюшиеся нормально в других, называются условно летальными. Они могут быть размножены и исследованы. В генетике фатов важны два основных типа условно летальных мутантов. Первый тип-это температурочувствительные мутинты (Гв). Большинство фатов способно инфицировать хозяина и размножаться в широком интервале температур.
Температурочувствительные мутанты многих фагов Е. сой способны размножаться при 30'С (пермиссивные условия), но теряют эту способность и обнаруживают свой мутантный феиотип при температуре 40-42'С (непермиссивные условия). При такой температуре негативные колонии не образуются. Известны также мутанты, чувствительные к холоду (св).
Появление температурной чувствительности почти всегда свидетельствует о том, что в каком-то участке ДНК, кодируюшем некоторый белок, произошла мутация, повлекшая за собой аминокислотную замену. В результате белок становится нестабилен при непермиссивной температуре и утрачивает активность. Второй тип условно летальных мугантов — супргссорчувствительные мутанты (виз). Фаги с мутацией вив могут размножаться при инфицировании бактериальных клеток с геном супрессора Яи+, т.е.
в пермиссивных условиях, но не в состоянии размножаться при инфицировании клеток других штаммов, не содержащих гена супрессора (Бп ), т.е. в непермиссивных условиях. Фаг дикого типа размножается в клетках обоих типов (табл. 7.1). Супрессорчувствительные мутации в отличие от мутаций специфичности к хозяину не влияют на способность фага адсорбироваться.
Такой фаг нормально прикрепляется к поверхности бактерии, вводит в нее свою ДНК и даже может убить клетку-хозяина, но нс способен к размножению. Существуют три класса супрессорчувствительных мутаций, атЬег(ат), осйге(осй) и ора1(ор). Здесь мы лишь упомянем о них как о генетических маркерах. Они могут затрагивать все гены, кодируюшие синтез белков. Мутация нарушает синтез белка в клетках хозяина типа Бп, но не препятствует синтезу белка в клетках типа Вп «. Биохимическую природу этих мутаций и механизм супрессии мы обсудим в гл. 12. После этого краткого обзора различных типов мутантных фатов вернемся к генетическому анализу фаговых мутаций. Это позволит нам понять организацию генома вирусов.
195 7. Геном вируса Комплементационный анализ условно летальных мутаций фага Ф Х174 Фаг фХ! 74 — мелкий вирус, содержащий кольцевую одноцепочечную молекулу ДНК (рис, 7.3). После проникновения в клетку-хозяина синтезируется комплементарная цепь ДНК и образуется двухцепочечная молекула, которая затем в начале скрытого периода реплицируется по полуконсервативному механизму. После того как нарабатывается достаточное количество белков головки и начинается сборка фатов, ДНК начинает реплицироваться посредством видоизмененно~о сигма-механизма, при котором синтезируется только фаговая цепь, и в головку фагов включаются одноцепочечные кольцевые молекулы фаговой ДНК. Эта последовательность необходимых для размножения фага собглтий была расшифрована посредством генетического анализа.
В таблице 7.2 перечислены 39 условно летальных мутаций фага фХ174; все они лишают фаг способности к размножению при инфицировании в непермиссивных условиях. Для того чтобы определить, влияют ли две независимо возникшие мутации на одну и ту же генетическую функцию или на разные, можно использовать комплементационный тест, описанный в предыдущей главе. Бактериальные клетки одновременно заражают фагами обоих мутантных типов при непермиссивных условиях, например при температуре 42'С, если оба мутанта чувствительны к температуре.
Если в таких дважды инфицированных бактериальных клетках потомство фатов возникает, можно сделать вывод, что каждый фаг осуществляет функцию, которую не может осуществить другой (см. рис. б.б). Такие две мутации называются хомплементарными и относятся к разным генам.
Выполняемый таким образом тест на комплемеитацию полностью аналогичен описанному в гл, б для мутантов эукариот. Возникает как бы «диплоидная» инфицированная клетка, в которой хромосома каждого фага несет по одной мутации, и наблюдается «диплоидный» фенотип, т.е. потомство фага либо возникает, либо нет. Заметим, что для выполнения теста на комплементацию нам не надо определять генотип фагового потомства.
Комплементационный анализ перечисленных в табл. 7.2 мутантов показывает, что они относятся к восьми различным группам комплементации. Так, например, при заражении непермиссивных бактерий фатами агл!0 (цистрон Р) и агн9 (цистрон 6) их клетки лизируются, и, следовательно, потомство фагов возникает. Напротив, при заражении непермиссивного хозяина фага аш9 и анс32 потомство не возникает, и. следовательно, эти две мутации относятся к одной и той же группе комплементации (цистрон 6). Если считать, что частота возникновения мутаций во всех генах примерно одинакова, то из факта, что в большинстве групп комплементации локализовано по нескольку мутаций, по-видимому, следует, что все зги мутации в совокупности затрагивают все важные гены фХ174.
Другими словами, исследовано достаточное количество независимых мутаций для построения генетической карты. Далее мы увидим, что такое разделение на группы комплементации правильно отражает (за единственным исключением) механизм биохимического функционирования фага. ~з* )9б Организация и передача генетического материала Рис. 7гй А. Электрон- ная микрофотография фаговых частиц фХ!74 ( х !90 000). Внизу справа — фрагменты фо- тографии, иа которых видна организапия субъединиц капсида. (.1е)угеу Тготат, (зг. ЯоЬегг И'.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
