10761 (684968), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Следует отметить, что на сегодняшний день одним из наиболее эффективных способов предотвращения повреждений тканей, вызванных гипоксическим состоянием, является интервальная гипоксическая тренировка. До настоящего времени считалось, что основной механизм адаптационного эффекта всех видов гипоксической тренировки обусловлен активацией антиоксидантных ферментов, усиливающих защиту организма от воздействия активных форм кислорода [28,41]. Недавно в лаборатории Скулачева было показано, что незначительное снижение мембранного потенциала (~ на 13%) ведет к существенному (до 80%) уменьшению продукции супероксид-анионов [34]. Следует отметить, что в митохондриях образуется до 95% супероксид-анионов клетки [11,54,60].

Ранее было высказано предположение, что активация митоК_АТФ и увеличение экспрессии гена, кодирующего этот белок, играют роль в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [39,55,65], однако прямых доказательств этому предположению получено не было, поэтому в данной работе была поставлена цель – выяснить роль митоК_АТФ в адаптации к гипоксии.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа из митохондрий печени крыс

В работе использовали самцов крыс линии Вистар.

Для выделения белка проводили выделение митопластов, экстракцию белков из митопластов, отделение водорастворимых белков от нерастворимых в воде. Дальнейшее разделение водорастворимых белков осуществляли методом ионообменной хроматографии, с повторным проведением хроматографии фракций, где был обнаружен белок с М_r 55 кДа. Фракции после хроматографии проверяли с помощью SDS-электрофореза и, если было необходимо, на приборе для определения проводимости бислойных липидных мембран. Далее проводили нативный форез фракций после повторной хроматографии, в которых с помощью SDS-фореза был обнаружен белок с М_r 55 кДА и концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ).

2.1.1. Выделение митопластов из митохондрий печени крыс

Для одного выделения обычно декапитировали 10 крыс, у которых извлекали печень.

Печень измельчали в специальном прессе, затем гомогенизировали в десятикратном объеме 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4 с использованием автоматического гомогенизатора при 240 об/мин.

Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге К-70: 4 мин при 1200 об/мин (400g), затем 6 мин при 1500 об/мин (600g). В этих условиях осаждаются ядра и мембранные структуры.

Супернатант центрифугировали на РС-6 20 мин при 4800 об/мин (3500g). В этих условиях осаждается митохондриальная фракция. Осадок собирали и промывали в 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, затем ресуспендировали.

Повторное центрифугирование проводили на РС-6 20 мин. при 4800 об/мин (3500g). Осадок собирали, мерили его объем.

Доводили полученные митохондрии Tris-HCl (10 мМ, pH 7.4) до 500 мл.

Оставляли при перемешивании и температуре 4°С на 30 мин. В результате получались митопласты.

Митопласты центрифугировали при 5500 об/мин на РС-6 (4000g) в течение 20 мин.

Осадок объединяли. Измеряли его объем и концентрацию белка. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически (длина волны 750 нм) по методу Лоури (Лоури, 1965). Исходя из полученных данных, митопласты разводили бидистиллированной водой до концентрации 44 мг/мл.

2.1.2. Экстрагирование белков из митопластов

К полученной суспензии митопластов добавляли 9 объемов 66%-го этилового спирта. Экстракцию белков вели при перемешивании суспензии в течение 30 мин при 4°С. После экстракции суспензию центрифугировали при 5500 об/мин (4000g) в течение 15 мин.

2.1.3. Отделение водорастворимых белков от нерастворимых

Полученный супернатант диализовали против 5 мМ Tris-HCl pH 7.4 (c 2-меркаптоэтанолом – 0,0005%). Объем буфера составлял 2 л. Затем центрифугировали при 100000g 30 мин.

2.1.4. Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе

Буфер «А» (Tris 50 mM, EDTA 0.5 mM pH 7.4; 125 мкл 2-меркаптоэтанола на 250 мл буфера после доведения рН)

Буфер «Б» (1М КСl в буфере «А»). Из него готовили ступенчатый градиент: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ КСl.

Взвешивалили DEAE-целлюлозу из расчета 1 г целлюлозы на 1 мл колонки. Целлюлозу промывали три раза деионизированной водой, затем буфером «А». Наносили на колонку. Промывали буфером «А» после нанесения.

Супернатант наносили на колонку c DEAE-целлюлозой (высота 2 см, объем 2 мл), предварительно уравновешенную буфером «А». После нанесения белков колонку промывали двойным объемом буфера «А» (Tris 50 мM, EDTA 0.5 мM pH 7.4).

Белки элюировали градиентом KCl: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ. Собирали по две фракции каждой концентрации соли. Каждая фракция по 2 мл. Полученные фракции проверяли на электрофорезе в ПААГ.

2.1.5. SDS-электрофорез в ПААГ

Белки разделяются по их молекулярным массам. Додецилсульфат натрия (SDS), связываясь с заряженными молекулами, компенсирует различия между зарядами белков.

Приготовление проб: в 30 мкл каждой фракции с DEAE-cell колонки добавляли по 15 мкл SLB.

Приготовление SLB:

1. SLB без меркаптоэтанола: 1.4 г SDS + 6 г глицерина + буфер, pH 6.8, без SDS - 7.5 мл, доводили деионизированной водой до 20 мл.

2. SLB для проб: 1 мл SLB без МЭ (1); 45 мкл МЭ; 45 мкл бромфеноловый синий .

Приготовление маркера:

10 мкл маркера (0.1 мг/мл) + 120 мкл SLB (1)

Приготовление кумасси: 600 мг кумасси голубого; 200 мл 96% этанола; 40 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 200 мл воды.

Концентрированный буфер для форезной камеры: 7.6 г Tris-HCl + 36 г глицина доводили дистиллированной водой до 800 мл и рН 8.3-8.8. После этого в буфер добавляли 2.5 г додецилсульфата натрия.

Рабочий буфер для форезной камеры: Разводили концентрированный буфер в 5 раз.

Буфер для разделяющего геля: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл воды доводили до рН 8.8), затем добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

Буфер для концентрирующего геля: Tris-HCl 0.5 М (3 г на 50 мл). После доведения рН до 6.8 добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

40% - бис-акриламид (60 мл): акриламид 23.34г.; бис-акриламид 0.64г.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 2.

Таблица 2. Приготовление гелей для SDS-электрофореза в ПААГ.

П р и м е ч а н и е: TEMED вносится непосредственно перед заливанием геля.

После полимеризации гелей пробы (в т.ч. метчик) кипятили на водяной бане в течение 5 минут и горячими наносили в карманчики геля. Маркер (рабочий) наносили в объеме 1/6 от объема проб.

Электрофорез проводили при силе тока 20 мА на одну пластинку. Когда пробы входили в разделяющий гель, силу тока увеличивали в 2 раза и оставляли до тех пор, пока краска не доходила до конца геля (1.5-2 часа).

Красили кумасси примерно 15 мин. Затем отмывали 7.5 % уксусной кислотой в течение ночи на шейкере. Если было необходимо, окрашивали серебрением (таблица 3).

Таблица 3. Окрашивание серебрением (Silver staining, Shevchenko at al., 1996)

Фракции, в которых при электрофорезе обнаружен белок с M_r 55 кДа, диализовали против 5 мМ Tris-HCl, pH 7.4.

Диализат наносили на вторую колонку с DEAE-целлюлозой (высота 1 см, объем 1 мл).

Смывали белки таким же градиентом по два объема колонки.

Фракции после первой и второй колонки проверяли на приборе для определения проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ).

2.1.6. Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)

Электрическая часть прибора для измерения проводимости бислойных липидных мембран представляет собой амперметр, измеряющий силу тока при определенной разности потенциалов между электродами. Сила тока зависит от проницаемости (сопротивления) мембраны, разделяющей раствор электролита в кювете. Исходя из этого, можно определить проводимость мембраны (проводимость = 1/ сопротивление).

Проводимость билипидного слоя очень близка к нулю (10^-12 пСм) при умеренном напряжении. Абсолютное значение напряжения более 150 мВ «рвет» билипидный слой.

Проводимость отличная от нуля определяется белками, встроенными в билипидный слой.

Проводимость нелинейно зависит от напряжения (в случае БЛМ), поэтому определяется проводимость при различных напряжениях.

Подготовка кювет: до и после работы кюветы отмывали детергентами, затем 10-15 минут споласкивали в струе воды (в стакане). Промывали дистиллятом, протирали спиртом, промывали дистиллятом от спирта. Ставили сушиться. Когда кюветы высыхали, смазывали отверстие в меньшей кювете липидами снаружи и внутри и давали высохнуть. Вставляли меньшую кювету в большую. Наливали в каждую кювету по 1 мл среды.

Среда для БЛМ: 3 M KCl; 20 мМ Tris, pH 7.4.

Приготовление липидов: 20 мкл общих липидов мозга и 26 мкл кардиолипина (Blight et al., 1959). Смесь близка по составу к митохондриальным липидам.

Затем эту смесь сушили аргоном, чтобы испарился хлороформ и метанол.

В пробирку с высушенными липидами добавляли 80 мкл н-декана, чтобы растворить липиды перемешивали.

Работа на приборе: наливали в каждую кювету по 800 мкл буфера; вставляли два электрода в кюветы; включали приборы; наносили липиды на отверстие в меньшей кювете, используя микроскоп. Ждали, пока цветная (полислойная) мембрана станет черной (бислойной).

В одну из кювет (обычно транс-) добавляли необходимое количество белка, а в другую (цис-) такое же количество среды для БЛМ, причем с расчетом, чтобы содержание KCl в обеих кюветах было изоосмотическим.

В случае появления проводимости, ее регистрировали две-три минуты, затем меняли напряжение, и ингибировали проводимость АТФ.

2.1.7. Нативный электрофорез

При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.

Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды.

Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.

Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.

Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.

Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.

Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу.

Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).

После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции.

Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.

Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час.

После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.

2.1.8. Концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля

Фракцию помещали в диализный мешочек (его можно ставить вертикально, тогда ПЭГ должен покрывать мешочек на 1/3). Мешочек клали в бюкс или чашку Петри и засыпали ПЭГ.

Характеристики

Список файлов ВКР