10761 (684968), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

2.2. Выделение митохондрий из печени крыс

Среда выделения (200 мл, рН 7.4): маннитол 210 мМ; сахароза 70 мМ; HEPES (N-2-гидроксиэтилперазин–N’-этансульфоновая кислота) 10 мМ. Среду разделяли на три части. В одну 37 мг ЭДТА на 100 мл среды, в другую 45 мкл 0,1 М ЭГТА на 100 мл среды. Третью (три миллилитра) оставляли без изменений.

Все процедуры проводили при 4 °С. Взвешенный физраствор предварительно охлаждали. Затем взвешивали вместе с печенью. Измельчали печень в прессе, затем гомогенизировали, разбавив средой с ЭДТА в девять раз.

Центрифугировали 4 мин при 250 g, затем 6 мин при 600 g. В результате этого осаждались ядра и обрывки мембран.

Супернатант центрифугировали 20 мин при 4500 g.

Осадок ресуспендировали в среде с ЭГТА и центрифугировали 20 мин при 4500 g.

Осадок ресуспендировали в среде без ЭГТА и без ЭДТА в соотношении 100 мкл среды на каждый грамм ткани и ставили в лед.

2.4. Выделение митохондрий из сердца крыс

Среда выделения (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; маннитол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЭГТА 2 мМ. Среду разделяли на три части. В одну (10 мл) добавляли 1 мг протеазы (непосредственно перед выделением). В другую (70 мл) - добавляли 140 мг БСА. В третью (70 мл) ничего не добавляли.

Все процедуры проводили при 4 °С.

Сердце помещали в предварительно охлажденный физраствор и взвешивали. Затем клали сердце в среду с протеазой на 10 минут, измельчая сердце ножницами. Через 10 минут часть жидкости сверху сливали, чтобы удалить частички жира и связки. Далее разводили средой с альбумином в 9 раз и гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали пять минут при 650g (осаждаются ядра и обрывки мембраны).

Супернатант центрифугировали 10 мин при 8000g.

Осадок ресуспендировали в среде без альбумина, центрифугировали 10 минут при 8000g.

Осадок вновь ресуспендировали в среде без альбумина из расчета 0.1 мл среды на 1г ткани сердца и ставили в лед.

2.5. Определение параметров транспорта К⁺ с помощью

К⁺ -селективного электрода

Ион-селективные электроды позволяют определять концентрацию ионов в растворе, которая зависит от разности потенциалов, возникающей между электродом и электродом сравнения.

Среда для К⁺ - электрода (рН 7.2-7.4): Сахароза 150 мМ; Трис(гидроксиметил)метиламин 10 мМ; NaH₂PO₄ 5 мМ. Использовали прибор «Record 4».

Калибровали шкалу.

В ячейку добавляли: 1 мл среды; модуляторы каналов, ингибиторы цепи и т. п.; митохондрии; ДНФ (5 мкл); triton x-100 (5 мкл, 10%).

После измерений кювету промывали.

Определяли скорость выхода ионов калия и его количество в митохондриях.

Пересчитывали скорость выхода калия и его количество на милиграмм белка митохондрий.

2.6. Определение параметров дыхания с помощью кислородного электрода Кларка

Среда для электрода (рН 7.4): 150 мМ сахароза; 50 мМ хлорид калия; 5 мМ дигидрофосфат натрия; 0.5 мМ хлорид магния; 10 мМ хепес. Использовали прибор «Record 4».

Калибровку шкалы выполняли по двум точкам. «Ноль» нмоль кислорода устанавливали при добавлении дитионита натрия (несколько мкг), так как дитионит является сильным восстановителем. 250 нмоль кислорода соответствует содержанию кислорода в среде дыхания объемом 1 мл.

В ячейку добавляли 1 мл среды. 1 мМ Rotenon, 5 мМ сукцинат, митохондрии, 200 мкМ АДФ, ДНФ (5 мкл).

Программа автоматически рассчитывает скорость дыхания.

Скорости: до добавления АДФ, после добавления АДФ, после фосфорилирования АДФ, после добавления разобщителя измеряли на самом прямом участке.

Пересчитывали скорость дыхания на миллиграмм белка митохондрий.

2.7. Спектрофотометрическое определение скорости

набухания митохондрий

Потенциал-зависимый вход ионов К⁺ в митохондрии вызывает вход осмотически облигатной воды, что ведет к набуханию и увеличению оптической плотности.

Среда для набухания: КCl 50 mM; NaH₂PO₄ 5 mM; MgCl₂ 0.5 mM; Hepes 5 mM; EGTA 100 мкM.

В кювету добавляли: 5 мкМ цитохром С - 4 мкл; 1 мМ Rotenone (если в качестве субстрата сукцинат) – 10 мкл; 2 мл среды; модуляторы, активные вещества, и. т. п; митохондрии.

Использовали метод динамического определения оптической плотности при длине волны 520 нм, установив время измерения равное трем минутам. Через полторы минуты добавляли субстрат (сукцинат или малат с глутаматом). По окончании измерения данные сохраняли в Excel и рассчитывали изменение оптической плотности в минуту на милиграмм белка митохондрий.

2.8. Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс

Группу самцов линии Вистар, поместив в барокамеру и снизив давление до 22 кПа, подвергли острой гипобарической гипоксии, соответствующей подъему на высоту 11500 м. Те животные, что выдерживали гипоксию в течение 10-15 минут, считались высокоустойчивыми. Низкоустойчивые крысы выдерживали эту высоту только в течение полутора минут. Среднеустойчивых крыс в эксперимент не брали. Адаптация низкоустойчивых крыс проводилась методом интервальной нормобарической гипоксии. Для этого животные помещались в камеру с контролируемой подачей воздуха. В течение двенадцати дней животным ежедневно по пять раз в день подавался воздух с вдвое сниженной концентрацией кислорода в течение 10 минут с трехминутными перерывами, во время которых животным подавался воздух с нормальной концентрацией кислорода.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа

В

1 2 3 4 5 6

ыделение белка с м. м. 55 кДа из внутренней мембраны митохондрий печени крыс проводили методом водно-этанольной экстракции [3]. Очистка белка проводилась методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы в качестве носителя. Присутствие белка во фракциях обнаруживали с помощью SDS-электрофореза в 10%-ом ПААГ (рис 3).

Рисунок 3. SDS-электрофорез фракций после повторной хроматографии. На треке 1 – маркер. На треках 2,3 – белок с Мr 55 кДа (фракции с 250 мМ КСl)

Дополнительная проверка фракций проводилась на приборе для определения проводимости искусственных бислойных мембран. При встраивании белка фракции, содержащих канальную субъединицу мито-К⁺_АТФ обнаруживалась проводимость мембран, ингибируемая АТФ (рис 4).

Для дополнительной очистки проводили повторную хроматографию активной фракции. Для окончательной очистки белка до электрофоретически гомогенного состояния проводился нативный электрофорез активной фракции с последующей элюцией белка с геля.

Рисунок 4. К⁺-транспортирующая АТФ-ингибируемая активность белка с молекулярной массой 55 кДа, реконструированного в искусственную мембрану.

Электрофоретически гомогенный АТФ-ингибируемый К⁺-транспортирующий белок с M_r 55 кДа замораживали и накапливали для иммунизации. При выделении вышеописанным методом из 100 г печени крыс получали 30-70 мкг очищенного белка. Иммунизацию кроликов проводили при накоплении 0.2-0.4 мг белка.

3.2. Определение параметров дыхания у крыс с различной устойчивостью к гипоксии и адаптированных к ней

Определение проводилось с помощью кислородного электрода Кларка. Определялась скорость дыхания (V3) и скорость фосфорилирования АДФ (V2) в митохондриях печени и сердца трех групп крыс. Полученные данные представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, митохондрии печени высокоустойчивых к гипоксии крыс скорости дыхания во всех метаболических состояниях, а также в присутствии разобщителя ниже по сравнению с этими скоростями у низкоустойчивых животных. Этот эффект не зависел от наличия К⁺ в среде

Таблица 5. Скорость дыхания в митохондриях печени крыс с различной устойчивостью и адаптированных к гипоксии с использованием двух сред и сукцината в качестве дыхательного субстрата.

инкубации митохондрий. Адаптация к гипоксии низкоустойчивых животных ведет также к снижению всех скоростей, однако, в присутствии ионов калия,

эти скорости дыхания снижаются не столь значительно. Последнее может указывать на активацию транспорта ионов К⁺ в митохондриях при адаптации животных к гипоксии. Следует отметить, что эти эффекты больше проявляются по отношению к скорости дыхания в присутствии субстрата (V2, V4) по сравнению со скоростью АДФ-стимулируемого дыхания (V3). Это может быть связано с увеличением концентрации АТФ в митохондриях после фосфорилирования добавленного АДФ. Как известно, АТФ ингибирует вход катионов К⁺ в митохондрии.

Обнаружено также, что у адаптированных к гипоксии животных дыхательный контроль в среде с ионами К⁺ снижен по сравнению с этим показателем у низкоустойчивых к гипоксии животных. Это снижение наблюдается только в среде, содержащей катионы К⁺, что может указывать на активацию энергозависимых процессов в митохондриях.

Совокупность полученных данных указывает на то, что 1) адаптация к гипоксии ведет к ингибированию работы фосфорилирующей дыхательной цепи, независимо от присутствия или отсутствия ионов К⁺ в среде, вероятно, за счет активации гликолиза и 2) адаптация ведет также к активации знергозависимого входа К⁺ в митохондрии.

Для подтверждения полученных данных у этих же животных были определены параметры АТФ-зависимого транспорта ионов К⁺ в митохондриях, а также количество катионов К⁺ в них.

3.3. Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта

ионов калия в митохондриях

Исследование параметров проводилось на двух моделях:

А) Модель энергозависимого набухания митохондрий.

Увеличение концентрации ионов К⁺ матриксе провоцирует осмотически облигатное поступление воды и, следовательно, набухание митохондрий. Изменение объема митохондрий влияет на их оптическую плотность. Следовательно, активность канала можно определить методом динамической спектрофотометрии.

Скорость энергозависимого входа ионов К⁺ определялась у крыс с различной устойчивостью, а также адаптированных к гипоксии крыс. Данные представлены в таблице 6.

Характеристики

Список файлов ВКР