10761 (684968), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Недавно стало известно, что синтез NO может происходить локально в митохондриях, возможно, за счет существования специфичной митохондриальной NO-синтетазы – mtNOS [59]. Было показано, что образованный в тканях NO обладает активирующим действием на митоК_АТФ [15, 36, 57]. Так как дыхательная цепь митохондрий является постоянным источником супероксид аниона, который легко вступает в реакцию с NO, вполне вероятно, что в митохондриях происходит образование пероксинитрита ONOO^- [38]. Предполагают, что активирующий эффект NO и пероксинитрита (ONOO^-) на митоК_АТФ осуществляется через активацию протеинкиназы С [35].

1.3. Фармакологическая модуляция митохондриального

АТФ-зависимого калиевого канала

Классификация митоК_АТФ как селективного К⁺ канала, напоминающего изоформу цитоК_АТФ, следует, в основном, из того, что оба канала имеют общие активаторы и ингибиторы. В настоящее время обнаружено большое количество подобного рода фармакологических агентов [51]. Эти данные обобщены в таблице 1.

Таблица 1. Модуляторы цитоплазматического и митохондриального К_АТФ каналов.

Селективность действия модулятора зависит от типа изучаемых клеток, условий эксперимента и, в основном, от используемых концентраций. Диазоксид и никорандил, например, активируют не только митоК_АТФ, но в более высоких концентрациях также активируют и цитоК_АТФ [16,58]; 5-HD помимо митоК_АТФ ингибирует при низких значениях рН цитоК_АТФ, активируемый АДФ [47].

Известно, что MCC-134, аналог априкалима, в поджелудочной железе ингибирует, а в гладкой мускулатуре активирует К_АТФ каналы. Недавно было показано, что этот препарат ингибирует митоК_АТФ, но активирует цитоК_АТФ в кардиомиоцитах.

Недавно, в лаборатории митохондриального транспорта было показано, что дифосфонуклеотиды являются активаторами канала, причем наиболее выраженный эффект наблюдался при активации канала УДФ.

Было показано, что дифосфонуклеотиды, такие как АДФ и ГДФ активируют реконструированную в БЛМ канальную субъединицу [29,43]. Данные по активирующему действию ГДФ в дальнейшем были подтверждены и другими исследователями [12]. Недавно было показано, что в ряду дифосфонуклеотидов наиболее эффективным является уридиндифосфат (УДФ) [42]. Этот фосфонуклеотид в микромолярных концентрациях активирует митоК_АТФ. Для активации цитоК_АТФ нужны значительно большие концентрации УДФ [8]. Реконструированный в БЛМ канал (митоKIR), после ингибирования АТФ, полностью реактивируется 20 мкМ УДФ. В интактных митохондриях, где присутствуют обе субъединицы, канал реактивируется теми же концентрациями УДФ, и эта активация снимается глибенкламидом и 5-НD [42]. Следовательно, участок связывания УДФ локализуется на канальной субъединице.

Функцию метаболических регуляторов могут выполнять также гормоны. Еще на первых этапах исследования митоК_АТФ в лаборатории митохондриального транспорта обнаружено, что прогестерон ингибирует его канальную субъединицу. В настоящее время появились данные о том, что женский половой гормон -эстрадиол является, вероятно, активатором митоК_АТФ, так как он обладает кардиопротекторным действием, которое снимается 5-НD [61].

Мужской половой гормон – тестостерон, также оказывал как активирующее митоК_АТФ, так и кардиопротекторное действие [20]. При измерении активности митоК_АТФ по флуоресценции флавопротеидов в митохондриях сердца, а также методом петч-кламп по регистрации электрических характеристик мембран митопластов было установлено, что тестостерон вызывал окисление флавопротеидов и активацию каналов. Оба эффекта зависели от присутствия в среде К⁺ и были чувствительны к АТФ. Показано, что тестостерон оказывал эффект только на митоК_АТФ и не влиял на цитоК_АТФ [20].

Каналы, образованные в БЛМ белком с молекулярной массой 55 кДа, регулируются АТФ, как было ранее показано [3], который способен значительно снижать проводимость модифицированной белком мембраны. Ионы Mg²⁺ не оказывали значительного влияния на ингибирование канала АТФ.

В интактных митохондриях можно также наблюдать АТФ-зависимый транспорт калия, используя модель энергозависимого входа калия. АТФ в присутствии MgCl₂ способен был подавлять энергозависимый вход калия в митохондрии. Однако, в отличие от данных, полученных при реконструкции этого белка в искусственные мембраны, действующая концентрация АТФ значительно ниже. Другим отличием является абсолютная необходимость Mg²⁺ для ингибирования АТФ в случае интактных митохондрий, в то время как при реконструкции белка с М_r 55 кДа в БЛМ, Mg²⁺ не оказывает существенного влияния на эффект ингибирования калиевого канала АТФ.

Различия в действии Mg²⁺, возможно, объясняются тем, что Mg²⁺ - связывающий участок локализован на регуляторной субъединице канала. Связывание регуляторной субъединицы с магнием увеличивает, вероятно, сродство к АТФ каналообразующей субъединицы.

Ингибирование нуклеотидом, вероятнее всего, осуществляется за счет его связывания в специфическом участке, а не в результате фосфорилирования белка, хотя таковое может иметь место. Интересно, что присутствие магния не является необходимым условием для ингибирующего эффекта АТФ при реконструкции митоKir (белка с М_r 55 кДа) в искусственные мембраны, следовательно, Mg²⁺ проявляет свой эффект только в интактных митохондриях, то есть при наличии двух субъединиц.

Так как ингибирующий эффект АТФ проявляется и при реконструкции только каналоформирующей субъединицы (митоKir) в БЛМ и липосомы, логично предположить, что нуклеотидсвязывающий участок расположен на каналообразующей субъединице, однако регуляторная субъединица (митоSUR) повышает сродство каналов к нуклеотиду.

В исследовании по регуляции транспорта калия адениновыми нуклеотидами с использованием модели выхода ионов K⁺ из митохондрий в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования было обнаружено, что ингибитор адениннуклеотидтранслоказы ― атрактилозид в концентрации 1 мкМ полностью предотвращал ингибирующее действие АТФ. Следовательно, можно предположить, что для ингибирования канала АТФ должен транспортироваться внутрь митохондрий, где и происходит его связывание с каналом. Исходя из этого, представляется, что нуклеотидсвязывающий участок митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала располагается на обращенной в сторону матрикса части белка-канала.

1.4. Структура митохондриального АТФ-зависимого

калиевого канала

Структура цитоК_АТФ и ген ее кодирующий к настоящему времени известны. Установлено, что этот канал состоит из двух субъединиц: канальной и регуляторной. Канальная субъединица имеет М_r 43-46 кДа и формирует АТФ-зависимый калиевый канал, который не регулируется специфическими модуляторами канала. Регуляторная субъединица имеет М_r от 60 до 174 кДа, в зависимости от ткани, и придает каналу чувствительность к модуляторам [7].

Несмотря на то, что свойства, регуляция и физиологическое значение митоК_АТФ в настоящее время широко изучаются, солюбилизация его из митохондриальных мембран и изучение структуры проводятся лишь в отдельных лабораториях. Так как митоК_АТФ имеет ряд общих свойств с цитоК_АТФ и регулируется общими регуляторами, было предположено, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [43] и состоит из канальной субъединицы [42] и регуляторной [10]. МитоК_АТФ, также как и клеточный, является, по всей вероятности, гетеромультимером, состоящим из калиевого канала, белка с молекулярной массой 55 кДа, который имеет выпрямляющие свойства и который, по аналогии с цитоплазматическим каналом, назвали митоKIR [42] и рецептора, чувствительного к сульфонилмочевинам и поэтому названного митоSUR (Рис. 2) [10, 43].

Рис 2. Рабочая модель структуры митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (по Mironova et al., 2004)

Белок, выделенный из внутренней мембраны митохондрий печени крысы, который формирует в БЛМ АТФ-зависимые каналы и имеет М_r 55 кДа (митоKIR), не ингибируется глибенкламидом и специфическим ингибитором митоК_АТФ 5-HD, и не активируется кромакалимом и диазоксидом. В то же время эти препараты влияли на АТФ-зависимый калиевый транспорт в изолированных митохондриях [42].

Константа ингибирования АТФ на реконструированном в БЛМ митоKIR была значительно выше, чем в интактных митохондриях и Mg²⁺ для этого ингибирования не требовался. В то же время, для ингибирования фосфонуклеотидом канала, локализованного в интактных митохондриях, присутствие ионов магния было необходимо [42]. Те же различия были обнаружены при сравнительном изучении влияния АТФ и сульфонилмочевины на цитоKIR и целый цитоК_АТФ [62]. Целый цитоК_АТФ ингибировался значительно меньшими концентрациями АТФ, чем канальная субъединица и был чувствителен к сульфонилмочевине и активаторам, в то время как канальная субъединица такой чувствительности не проявляла. Из этих данных был сделан вывод, что основной участок связывания АТФ в цитоК_АТФ локализован на канальной субъединице, а регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [62].

Приведенные выше результаты исследований митоК_АТФ подтверждают предположение о том, что белок с М_r 55 кДа является канальной субъединицей целого митоК_АТФ. Однако, для более прямого подтверждения этого предположения нами были получены антитела (АТ) на этот белок и показано, что они ингибируют АТФ-зависимый калиевый транспорт в интактных митохондриях, не влияя при этом на другие функции митохондрий, такие как окислительное фосфорилирование и транспорт кальция [6]. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с М_r 63 кДа, связывающийся с меченым глибенкламидом [10].

1.5. Нарушения гомеостаза, вызванные гипоксией и механизмы его восстановления

Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи [1]. Восстановление переносчиков I и III комплексов цепи, приводит к увеличению образования АФК, которые активируют свободнорадикальные процессы в клетке [19, 32].

Можно выделить две основные физиологические роли свободнорадикального окисления в организме. Во-первых, этот процесс имеет место при катаболизме многих липидов и белков, что облегчает дальнейшее действие фосфолипаз и протеаз, сродство которых намного выше именно к окисленному субстрату [63], а также при синтезе физиологически активных веществ липидной природы (лейкотриены, тромбоксаны, простагландины). Во-вторых, АФК участвуют в начальных этапах клеточной сигнализации (редокс–сигнализация) в условиях стресса, гипоксии, воспаления, воздействия высоких и низких температур, физической нагрузки, и других патологических состояниях. Характер клеточного ответа будет зависеть от продолжительности и интенсивности воздействия вышеперечисленных факторов. При умеренном воздействии формируется неспецифический ответ, повышающий адаптацию организма к новым условиям. При воздействии высокой интенсивности, например, при глубокой гипоксии наступает некроз тканей, в том числе и за счет повреждающего действия АФК, активирующих перекисное окисление липидов и других биологических молекул [5].

Механизм протекторного действия заключен, по-видимому, в окислительно-восстановительных модификациях сульфгидрильных групп сенсорных белков, что приводит к активации тирозинкиназного пути клеточного ответа [5].

Одним из важнейших следствий инициации редокс-сигнализации и АФК-опосредованной передачи сигнала является активация ядерных факторов транскрипции, которые находятся в неактивном состоянии до тех пор, пока в их молекуле не произойдет отщепление ингибиторного домена. После этого, ядерные факторы транскрипции оказываются способными индуцировать многочисленные гены. Важную роль в настоящее время придают таким факторам транскрипции, как NF-kB [21], AP-1[41].

Среди известных к настоящему времени белков, которые синтезируются в ответ на редокс-сигнал от адаптирующего фактора, наибольшее значение имеет, прежде всего, ряд неспецифических молекул, таких как ферменты антиоксидантной защиты, белки семейства HSP и другие белки срочного ответа, которые могут синтезироваться в ответ на гипоксию, стресс, ишемию, реперфузию и т.д. [41]. Кроме того, синтезируются специфические молекулы с шапероновой активностью по отношению к конкретным белкам клетки, как показано, например для специфического шаперона Са-насоса саркоплазматического ретикулума [13], либо белки, специфически синтезирующиеся в ответ на действие конкретного фактора, например, в ответ на гипоксию [28].

Характеристики

Список файлов ВКР