10761 (684968)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В. Г. Белинского

Факультет Кафедра

Естественно-географический биохимии

Дипломная работа

Участие митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию

Студент ____________________________________________

подпись

Руководители __________________________________ Сметанин В. А.

подпись

______________________________________

подпись

К защите допустить. Протокол № от « _ » 200 г

Зав. кафедрой ____________________________________ Генгин М.Т.

подпись

Пенза, 2007 г

Содержание

Список сокращений ………………………………………………………...…..

Введение ……………………………………………………………………...….

Глава 1. Обзор литературы ……………………………………….………..........

1.1 Системы транспорта ионов калия в митохондриях ……………………….

1.2 Свойства и регуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала………………………………………………………………………………

1.3 Фармакологическая модуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала ………………………………………………………………...

1.4 Структура митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала ……

1.5 Нарушения гомеостаза, вызванные гипоксией и механизмы его восстановления ………………………………………………………………….

Глава 2. Материалы и методы …………………………………………………

2.1 Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа из митохондрий печени крыс………………………………………………………………………………

2.1.1 Выделение митопластов из митохондрий печени крыс………………...

2.1.2 Экстрагирование белков из митопластов………………………………..

2.1.3 Отделение водорастворимых белков от нерастворимых……………….

2.1.4 Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе……………………

2.1.5 SDS-электрофорез в ПААГ……………………………………………….

2.1.6 Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)….

2.1.7 Нативный электрофорез…………………………………………………..

2.1.8 Концентрирование белка методом обратного диализа с помощью полиэтиленгликоля …………………………………………………………...…

2.2 Выделение митохондрий из печени крыс……………………………….....

2.4 Выделение митохондрий из сердца крыс………………………………….

2.5 Определение параметров транспорта К⁺ с помощью

К⁺ -селективного электрода……………………………………………………..

2.6 Определение параметров дыхания с помощью кислородного электрода Кларка……………………………………………………………………………

2.7 Спектрофотометрическое определение скорости набухания митохондрий…………………………………………………………………….

2.8 Определение устойчивости к гипоксии крыс и адаптация к ней низкоустойчивых крыс…………………………………………………………

Глава 3. Результаты и обсуждение………………………………………….…

3.1 Выделение белка с молекулярной массой 55 кДа…………………………

3.2 Определение параметров дыхания у крыс с различной устойчивостью к гипоксии и адаптированных к ней……………………………………………...

3.3 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта ионов калия в митохондриях…………………………………………………………………….

3.4 Определение количества ионов К+ в митохондриях различных групп крыс……………………………………………………………………………….

Выводы…………………………………………………………………………..

Список литературы…………………………………………………………….

Список сокращений

БЛМ – бислойные липидные мембраны

митоК_АТФ – митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал.

цитоК_АТФ – цитоплазматический АТФ-зависимый калиевый канал.

АФК – активные формы кислорода.

митоKIR – канальная субъединица митоК_АТФ

митоSUR – регуляторная субъединица митоК_АТФ

ДЕБ – п-диметиламиноэтилбензоат

GSH/GSSG – окисленная / восстановленная форма глутатиона

МЭ – 2-меркаптоэтанол

ТЕМЕД – N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин

Тris – трис(гидроксиметил)метиламин

ПЭГ – полиэтиленгликоль

НУ – низкоустойчивые животные

ВУ – высокоустойчивые животные

А – адаптированные животные

5- НD – 5-гидроксидеканоат

HEPES - N-2-гидроксиэтилперазин–N’-этансульфоновая кислота

Введение

Любое патологическое состояние прямо или косвенно связано с нарушением кислородного гомеостаза организма. Инсульты, инфаркты, ишемические состояния различных органов, инфекционные заболевания - это лишь небольшой перечень тех патологий, в основе генеза которых лежит гипоксия.

В настоящее время многие исследователи склоняются к тому, что активация митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала является важным моментом в адаптации к гипоксии. [23, 30, 51].

Следует отметить, что этот канал был впервые изолирован из внутренней митохондриальной мембраны в лаборатории митохондриального транспорта [4], и в настоящее время проводится изучение его свойств [42].

В данной работе приводятся доказательства участия митохондриального АТФ-ингибируемого калиевого канала в адаптации животного к гипоксическому состоянию. Нами впервые обнаружено, что адаптация ведет к активации калиевого цикла в митохондриях.

В настоящее время обнаружен ряд модуляторов канала, влияющих на его активность. В связи с этим, существует перспектива использования этих модуляторов для повышения адаптации организма к гипоксическому состоянию.

Полученные данные были представлены на Всероссийской конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург 2007), на конференции.. (Пенза 2007), а также в сборнике научных работ «Современный мир, природа и человек» т.4 № 1 с. 40.(Томск, 2007)

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Системы транспорта ионов калия в митохондриях

Известно, что во внутренней мембране митохондрий локализуются ферменты синтеза АТФ, системы транспорта ионов и субстратов дыхания, а также переносчики электронов дыхательной цепи. При работе последних на мембране митохондрий создается потенциал () около 190 мВ, который используется для синтеза АТФ. Существование высокого отрицательного создает предпосылки для входа в митохондрии катионов, среди которых основным является калий. Вход катионов К⁺ ведет к набуханию митохондрий и нарушению их структуры. Поэтому было предположено, что для поддержания объема митохондрий в них, наряду с системой потенциалозависимого входа, должна существовать система выхода катиона [44]. В дальнейшем это было подтверждено экспериментально [24, 56].

Так как скорость входа калия в митохондрии мала [14], первоначально полагали, что он осуществляется лишь благодаря диффузии иона через мембрану, проявляющейся в незначительных токах утечки [25]. Действительно, кажется маловероятным, что на внутренней мембране митохондрий, при наличии столь высокой электродвижущей силы, природа создала специфические каналы для калия. Однако, еще в 1981 году в лаборатории митохондриального транспорта Г. Д. Мироновой [4], а в дальнейшем и другими исследователями [17], из внутренней мембраны митохондрий был выделен селективный для калия канал, выполняющий функцию унипортера, причем антитела к этому белку-каналу специфически ингибировали работу данного канала, не влияя на другие функции митохондрий [6]. В настоящее время уже общепринято, что в митохондриях существует две системы транспорта калия: система унипортера, осуществляющего вход калия по электрохимическому потенциалу, и K⁺/H⁺-обменник, транспортирующий калий из митохондрий в обмен на Н⁺ [26,27]. То есть, в митохондриях существует так называемый калиевый цикл (рис 1).

Рис 1. Митохондриальный калиевый цикл

(по Garlid and Paucek, 2003).

ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; ММП – межмембранное пространство.

Первым компонентом этого цикла, выполняющим функцию унипортера, является белок-канал с молекулярной массой 55 кДа [3, 4, 43]. Этот белок, при встраивании в бислойные липидные мембраны (БЛМ), формирует селективные для ионов калия каналы. Позднее было обнаружено, что данный канал ингибируется АТФ [53]. Существование природного ингибитора канала вполне логично, так как закрытие канала предотвращает неконтролируемое набухание митохондрий. К настоящему времени митоК_АТФ был обнаружен во внутренней мембране интактных митохондрий методом петч-кламп в нескольких лабораториях [12, 15, 20, 31, 45, 64].

Другим компонентом калиевого цикла является К⁺/Н⁺ - антипортер, который в настоящее время также выделен из внутренней мембраны митохондрий и молекулярная масса которого, по данным профессора Гарлида, равна 82 кДа [37]. Предполагается, что антипортер ответственен за поддержание объема митохондрий при увеличении скорости входа калия через внутреннюю митохондриальную мембрану. Открытие митоК_АТФ кратковременно сдвигает баланс между К⁺ - унипортером и К⁺/Н⁺ - антипортером до тех пор пока скорость выхода К⁺ через последний не достигает скорости входа К⁺.

В настоящее время установлено, что митоК_АТФ участвует не только в поддержании объема митохондрий, но и в адаптации животных к экстремальным воздействиям. По результатам, полученным на моделях гибернирующего суслика и адаптированных к холоду животных, в лаборатории митохондриального транспорта было высказано предположение об участии митоК_АТФ в несократительном термогенезе [2,18]. Продолжение исследований в этом направлении может иметь значение для решения проблем анабиоза и гипотермического наркоза. Кроме того, в настоящее время стала широко изучаться роль митоК_АТФ в кардиопротекции, что будет обсуждаться ниже.

1.2. Свойства и регуляция митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала

Изучение свойств митоК_АТФ показало, что он относится к семейству АТФ-зависимых калиевых каналов, впервые обнаруженных в цитоплазматических мембранах [46]. Основное общее свойство всех каналов, относящихся к этому семейству, состоит в том, что они ингибируются физиологическими концентрациями АТФ [31, 49, 53] и, являясь селективными для калия, обладают выпрямляющими свойствами, т.е. имеют разные скорости транспорта калия в зависимости от направления переноса ионов [31, 49].

Функционирование как митоК_АТФ, так и цитоК_АТФ зависит от редокс состояния активных групп белков-каналов. Установлено, что окислительно- восстановительные агенты модулируют работу митоК_АТФ. Донор электронов п-диметиламиноэтилбензоат (ДЕБ) активирует митоК_АТФ, а акцептор электронов - пеларгонидин ингибирует канал [29]. Эти реагенты влияют, вероятно, на SH-группы канала.

При гипоксии, как известно, в клетках значительно изменяется редокс баланс: наблюдается увеличение концентрации активных форм кислорода, изменение соотношений GSH/GSSG и НАД⁺/НАДН. Такие сдвиги могут привести к модификации тиоловых групп цистеинов.

Хорошо известно, что АФК образуются и накапливаются в организме при различных патологических состояниях, в частности, при ишемии. Однако, они могут образовываться в клетке при нормальном функционировании [48, 52] как побочные продукты аэробного метаболизма и играть значительную роль в работе дыхательной цепи [33], а также в процессах внутриклеточной сигнализации [22, 50].

В экспериментах со встроенным в БЛМ митоК_АТФ было показано, что добавление в среду инкубации системы генерации радикала супероксид аниона – ксантин/ксантин оксидазы, приводило к активации канала уже в течение первой минуты инкубации [64]. При этом вероятность открытого состояния митоК_АТФ возросла приблизительно в три раза. По-видимому, действие свободных кислородных радикалов на канал опосредовано различными механизмами и направлено на его сульфгидрильные группы.

Другим универсальным фактором регуляции метаболизма является оксид азота II (NО).

Характеристики

Тип файла документ

Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.

Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.

Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.

Список файлов ВКР