CBRR4293 (677223), страница 49

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 49)

ки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой систе-

мы, также как и других векторных систем на основе вирусов,

является возможность контаминации производящей клеточной ли-

нии нормальным ретровирусом и получения на этой основе ком-

петентного по репликации вектора. Для предотвращения этого

необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток.

Возможна также контаминация ретровирусного вектора клеточны-

ми РНК, некоторые из них могут обратно транскрибироваться и

встраиваться в геном трансдуцированных клеток. Последстия

такого события могут быть выявлены в экспериментах на живот-

ных моделях. Другими серьезными недостатками ретровирусных

векторов является: (1) их способность переносить генетичес-

кий материал только в пролифирирующие клетки; (2) способ-

ность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;

(3) возможность спонтанной активации онкогена; (4) небольшие

размеры переносимой ДНК-вставки - до 8 тысяч п.о.; (5) срав-

нительно низкий титр -10!6-10!7/мл рекомбинантных вирусных

частиц, получаемых для трансдукции; (6) необходимость конс-

труирования соответствующих "пакующих" клонов клеток.

_Аденовирусные векторы. . В отличие от ретровирусов адено-

вирусы активно инфецируют неделящиеся клетки, обладают боль-

шей потенциальной пакующей способностью (ДНК-вставка> 8 кб),

имеют высокий титр - 10!11/ мл, однако, не обеспечивают

встраивание чужеродной ДНК в геном трансформированной клетки

(Hodgson, 1955). Использование их перспективно для генокор-

рекции клеток верхних дыхательных путей, легких и других ор-

ганов - мозга, печени, мышц, кожи и пр. Они эффективны при

доставке аэрозольным способом, что было использовано в пер-

вых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза

(Crystal et al., 1994). В аденовирусные векторы также инсер-

тируют маркерные гены - neo, CAT или бета-галактозидазный

ген (бета-Gal) для того, чтобы идентифицировать трансдуциро-

ванные клетки. Для конструирования векторов используют де-

фектные по репликации аденовирусы, которые получают путем

вырезания из вирусной ДНК генов, кодируюших белки (E1a,

E1b)- так называемые аденовирусные векторы 2-го поколения. В

настоящее время создаются аденовирусные векторы 3-го поколе-

ния, в которых помимо генов Е1а и Е1b удаляют и регуляторный

ген Е4. Такая конструкция может поддерживаться только в при-

сутствии клеток-хелперов (например, в культуре клеток почек

человека). Удаление большего числа аденовирусных генов из

векторов часто сопровождается их дестабилизацией. Это один

из главных недостатков аденовирусных векторов, так как в ря-

де случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мише-

ни, способствуют формированию иммунного ответа. Именно выра-

женный иммунный ответ при повторных введениях аденовирусного

вектора с инсерцией гена CFTR, оказался наиболее серьезным

препятствием для успешной генотерапии муковисцидоза (Crystal

et al., 1994). Некоторые аденовирусные белки способны оказы-

вать цитотоксический эффект на высокоспециализированные

клетки человека. Схема поддержания аденовирусных векторов

сходна с той, которая используется для производства ретрови-

русных векторов. Велика опасность их контаминации хелперным

реплицирующимся вирусом. Кроме того, аденовирусы редко ин-

тегрируются в геномную ДНК и потому экспрессия переносимых

ими генов, как правило, носит временный характер

(Табл. 9.1). Способность инфецировать, практически, любые

клетки как in vivo, так и in vitro делает особенно актуаль-

ной адресную доставку таких конструкций и введение в их сос-

тав тканеспецифических промотров. Например, промотор гена

альфа-фетопротеина при необходимости экспрессии гена в клет-

ках печени, либо промоторы генов сурфактантных белков В и С

для экспрессии чужеродных генов в клетках легких.

_Аденоассоциированные вирусы . обладают значительно мень-

шей пакующей способностью (около 5 кб). Однако, в отличие от

ранее рассмотренных вирусов не обладают онкогенной актив-

ностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где

пребывают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV

является их способность к стабильной неслучайной интеграции

в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции ви-

руса определяется наличием в его геноме гена rep. Близко

родственные AAV, так называемые, парвовирусы (H1, MVM, Lu-

III), обладают еще меньшей пакующей способностью - около 2

кб и не имеют специфичного встраивания, однако, они также

рассматриваются как потенциально перспективные векторы.

_Вирус простого герпеса (HSV). . Крупный (152 кб) ДНК-со-

держащий вирус, при трансформации не интегируется в геном,

формируя в ядрах эписомные структуры. Уникальная особенность

HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной сис-

темы. Отсюда его перспективность как векторной системы для

лечения опухолей мозга, болезни Паркинсона и многих других.

Его известное преимущество - достаточно большая пакующая

способность (>30кб). Важным этапом в создании вектора на ос-

нове HSV является удаление из его генома области ICP22, от-

ветственной за синтез литических белков, и индукция мутации

1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее

время на основе HSV стали получать искусственные производные

вируса, так назывемые ампликон-продукты, лишенные, практи-

чески, всех генов HSV, но способные к репликации .

Конструкции векторов, используемых для переноса экзо-

генных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в

зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов,

сконструированных на основе псевдо-аденовирусов, сочетает в

себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом

собственные вирусные гены, практически, не оказывают никако-

го повреждающего эффекта на трансфецированные клетки-мише-

ни, так как содержат очень мало регуляторных элементов и

последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию

аденовируса. Кроме того, псевдо-аденовирусные векторы с ус-

пехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в де-

лящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспек-

тивы использования для генной терапии других вирусных сис-

тем, таких как SV40, вирус иммунодефицита (HIV), вирус вет-

ряной оспы и многие другие. В частности, заслуживают внима-

ния эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векто-

ры, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейн-Бар-

ра, способного нести вставку размером от 60 до 330 кб (Sun

et al., 1994).

9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем.

Обзор существующих данных позволяет придти к заключе-

нию, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все

уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные сис-

темы далеки от совершенства (Hodgson, 1995). Если проблема

доставки чуужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее

доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно реша-

ется (главным образом, путем создания комбинированных рецеп-

тор-опосредованных конструкций), то другие характеристики

существующих векторной системы - стабильность интеграции,

регулируемая экспрессия, безопасность - все еще нуждаются в

серьёзных доработках. Прежде всего, это касается стабильнос-

ти экспрессии. Последняя может быть достигнута либо при ин-

теграции чужеродной ДНК непосредственно в геном реципиента,

либо путем обеспечения длительной персистенции экзогенной

ДНК в ядре. До настоящего времени интеграция в геном дости-

галась только при использовании ретровирусных либо адено-ас-

социированных векторов (Табл. 9.1). Случайная интеграция

трансфектной ДНК в геном происходит достаточно редко, причем

в случае ретровирусных векторов это происходит только в де-

лящихся клетках. Повысить эффективность стабильной интегра-

ции можно путем совершенствования генных конструкций типа

рецептор-опосредованных систем (Рис. 9.2). Однако, эти век-

торные конструкции должны включать только часть вирусных ге-

нов, например, гены обратной транскриптазы, ретровирусной

интегразы, некоторые транспазоновые гены, парвовирусные

rep-гены (см. 9.4.4). Учитывая возможный мутагенный эффект

случайной интеграции, весьма перспективным представляется

создание достаточно стабильных эписомных векторов. В част-

ности, в последнее время особое внимание уделяется созданию

векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mam-

malian Artificial Chromosomes), которые могли бы достататоч-

но автономно находиться в ядре, сохраняя способность к реп-

ликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представ-

ляются автономно реплицирующиеся циркулярные микрохромосомы

раковых клеток (Hodgson, 1995).

Особенно привлекательной в плане генной коррекции

представляется возможность замены всего мутантного гена или

его мутировавшей части (например, одного экзона) на нормаль-

ный аналог, что может быть достигнуто путем гомологичной ре-

комбинации. При этом в идеале можно ожидать не только дли-

тельную персистенцию введенного гена, но и сохранение нор-

мальной экспрессии. С этой целью в конструкции, используемые

для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомо-

логичного спаривания, например, бактериальную рекомбина-

зу. Показано, что в этих условиях частота гомологичной ре-

комбинации может превышать 2.5*10-4. Это достаточно для то-

го, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток. Для

направленного введения фрагментов гена в строго определенные

локусы генома недавно разработана система двойной замены,

основанная на использовании HPRT-зависимых эмбриональных

стволовых клеток и векторной конструкции содержащей ген HPRT

(гипоксантин-фосфорибзилтрансферазы) и ген тимидин-киназы

вируса герпеса (HSV). Двойная селекция трансформантов позво-

ляет отобрать клетки, в которых произошла гомологичная ре-

комбинация. Такой подход нашел широкое применение при созда-

нии искусственных моделей наследственных болезней у человека

(см. подробней Главу VIII). Однако, в клинической практике

он еще не используется.

Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-

леваний.

Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно

рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander-

son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,

1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys-

tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли-

кованной монографии (Culver, 1994).

Уже через год после первого введения маркерного гена в

организм человека была проведена успешная клеточная сомати-

ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен-

ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом

заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон-

центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс-

твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз-

вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под-

держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич-

ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для

трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн-

зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению

состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре-

менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд-

никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен-

ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо-

цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление

этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо-

ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции

Характеристики

Список файлов реферата