CBRR4293 (677223), страница 50

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 50)

роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным

вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo;

отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут-

ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту.

Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет-

няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей

было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных

T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу-

зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла

число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир-

кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор-

мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак-

теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более,

чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в

кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор-

ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить

количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут-

ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых

клинических испытаний была начата программа генной терапии

ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий

трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де-

вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали-

зация соответствующих биохимических и иммунологических пока-

зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при

лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический

эффект (Anderson,1992; Culver, 1994).

Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста-

навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем,

что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых

T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те-

рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро-

ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови.

Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство-

ловых клеток показана в экспериментах на приматах.

Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму-

лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов

применительно к другим наследственным заболеваниям. В

Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи-

ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция

наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу-

ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания,

для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и

которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.

Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото-

рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери-

ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ).

(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)

---T----------------T-----------------------T----------------T----¬

¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста-¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия ¦

+--+----------------+-----------------------+----------------+----+

¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ ¦

¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦ ¦

¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ ¦

¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦ ¦

¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ ¦

¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ ¦

¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦9 ¦Эмфизема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лимфоциты ¦ ЭР ¦

¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦эпителий бронхов¦ КИ ¦

¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦ ¦

¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЭР ¦

¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦ ¦

¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦

¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦

¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦ ¦

¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР ¦

¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦ ¦

¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР ¦

¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦ ¦

¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР ¦

¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦ ¦

¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦

¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ ¦

¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦ ¦

¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦

¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ ¦

¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦ ¦

L--+----------------+-----------------------+----------------+-----

Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических

испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний.

Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле-

дования и отрабатывались требования, необходимые для получе-

ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1).

Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь-

ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива-

ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по

генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток

(Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для

генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле-

ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек-

ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо-

дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки

(лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые

клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то,

что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ-

ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек-

тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че-

ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по-

казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и

лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже-

нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост-

ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции

клеток крови соответствующими генами можно лечить не только

собственно заболевания крови, но и использовать их для лече-

ния многих других заболеваний как моногенной природы

(Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже).

Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод-

ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас-

ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо-

леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты

которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать

в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии

скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз-

ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе-

ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК.

Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио-

фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном

состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно-

го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про-

должительность экспрессии значительно увеличивается, если

генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас-

тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо-

бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии

таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина,

диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар-

кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны-

ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко-

жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма-

нипуляций ex vivo.

Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:

опухоли, инфекции.

Параллельно с развитием исследований в области генокор-

рекции наследственных дефектов успешными также оказались по-

иски методов терапевтического использования смысловых после-

довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний

и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин-

фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии

поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а

число уже одобренных протоколов клинических испытаний во

много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо-

лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому,

прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо-

гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной

терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические

подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и

широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих

подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными

инфекционными заболеваниями, например, со спидом.

Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек-

ции онкологических заболеваний.

---------------------------------T-----------------------------¬

¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦

+--------------------------------+-----------------------------+

¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦

¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦

¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦

¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦

¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦

¦ ности" либо генов "самоубийц"¦ цитозин дезаминазы ¦

¦4. Блок экспрессии онкогенов ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦

¦ ¦ гены внутриклеточных антител¦

¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦

¦ опухолей ¦ ¦

¦6. Защита нормальных клеток от ¦ гены лекарственной ¦

¦ химеотерапии. ¦ устойчивости тип 1. ¦

¦7. Индукция синтеза противоопухо¦ гены интерлейкина-2, ¦

¦ левых в-в нормальными клеткам¦ интерферона ¦

¦8. Продукция противопухолевых ¦ вакцины типа БЦЖ, экспресси-¦

¦ рекомбинантных вакцин. ¦ рующей опухолевой антиген ¦

¦9. Локальная радиопротекция нор-¦ гены трансферазы, ¦

¦ мальных тканей с помощью ¦ глутатион синтетазы ¦

¦ антиоксидантов. ¦ ¦

L--------------------------------+------------------------------

Подробный анализ используемых при этом подходов и ре-

зультаты первых клинических испытаний выходит за рамки наше-

го изложения. Однако, материал этот настолько интересный и

многообещающий, что мы позволим себе на нескольких примерах

охарактеризовать основные принципы построения таких геноте-

рапевтических программ.

Как упоминалось ранее (см. 9.1), перенос гена в орга-

низм человека был осуществлен в 1989 году в большей степени

в исследовательских, а не в терапевтических целях. Это был

маркерный прокариотический ген neo, сообщающий клеткам ус-

тойчивость к неомицину. Он был введен пациенту, страдающему

злокачественной меланомой, в составе трансдуцированных

TIL-клеток (Т -лимфоцитов, полученных из опухолевых тканей

больного). В 1986г. вскоре после идентификации этого нового

класса иммунных клеток, была предпринята попытка лечения ме-

ланомы путем аутологичной внутривенной инфузии TIL-клеток,

предварительно выделенных из опухолей пациентов и интенсивно

наращиваемых in vitro в присутствии ростового фактора IL-2.

Примерно у трети пациентов лечение оказалось эффективным,

хотя в последующем наблюдали значительное число рецидивов

заболевания. Для анализа причин терапевтического эффекта TIL

Характеристики

Список файлов реферата