CBRR4293 (677223), страница 19

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 19)

ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-

залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс

одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-

шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология

автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным

для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-

лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-

нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-

ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается

автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение

в реализации программы Геном человека. По последним данным,

разработка автоматических секвенаторов позволила снизить

стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-

ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах

фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-

но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.

В последние годы активно разрабатываются принципиально

новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-

ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой

последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-

ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский

и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для

этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых

пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-

да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-

рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-

деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество

возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-

емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют

с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется

только с теми октануклеотидами, последовательности которых

комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-

бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-

дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной

компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-

тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод

позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет

автоматизации процесса.

1.7 Полимеразная цепная реакция.

До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-

рование являлись единственными способами поиска и выделения

специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей

ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о

большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи-

альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые

фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш-

ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих

последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так

как определяются наличием соответствующих рестрикционных

сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе-

ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое

количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК

(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК

обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока-

зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях

и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед-

ленного использования собранной крови для выделения ДНК или

хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова-

ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи-

вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент-

ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не-

обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив-

ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны

быть использованы в течение очень короткого периода после их

приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом

требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали-

чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно

лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не-

обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд-

линяет время получения результатов, что также ограничивает

использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди-

агностики плода, специфика которой во многом определяется

сроком беременности.

Предложенный в 1983г. американским исследователем

Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской

премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -

метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным

открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или

специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте-

зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной

от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,

реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые

образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук-

леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,

так как специфический выбор этого участка осуществляют путем

гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-

ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями

ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-

концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой

нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между

праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка-

честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип

ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов

про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери-

альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для

проведения специфической амплификации не требуется больших

количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной

молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в

значительной мере связан с использованием в качестве фермен-

та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,

выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по-

тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,

1987).

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока-

зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая

матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг-

ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю-

щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно

проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации

или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,

комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-

шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за

счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50

С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго

специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе-

ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С,

начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого

участка, образованного праймерами. Затем при нагревании

раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух-

нитевой участок между матричными и вновь синтезированными

молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле

олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за-

тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку-

лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу-

чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного

режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро-

ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер

вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного

нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат-

ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для

амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации

в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из

процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой

реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят-

ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится

от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синте-

зированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР

обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого

специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.

Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и

выбирать оптимальные временные и температурные параметры для

каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы

возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень

проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме-

ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля-

ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают

небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст-

вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной

смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую

программу циклической смены температуры и длительности каж-

дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,

составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального

режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи-

цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для

каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,

длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич-

ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой

термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и

состав амплификационной смеси могут существенно варьировать

и зачастую подбираются эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места

локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а

также изучать наличие любых других специфических особен-

ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на

основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици-

руемого участка. Разработаны различные варианты автомати-

ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото-

рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации

специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри-

дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со-

держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме-

чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли-

чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные

органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг-

леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не

препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве

источника матричной ДНК может быть использован любой, даже

деструктурированный биологический материал, сохранивший в

своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных

молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен-

ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна

крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины

хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль-

туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не

прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге-

нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен-

ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши-

еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более

подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде

специальных руководств и инструкций.

Характеристики

Список файлов реферата