CBRR4293 (677223), страница 21

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 21)

ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов

тканеспецифической активации генов in vivo.

Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для

изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных

модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95%

из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли-

руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При

этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов

среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от

0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения

индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-

чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на

тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ

РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических

срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов

используют клонированные последовательности кДНК и синтети-

ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на

цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой

несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо-

вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли-

бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме-

тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не

только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде-

лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,

Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).

Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей

пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика-

цию среди них специфических молекул путем использования раз-

личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким

уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты

(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не

могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-

лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и

фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-

водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью

обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-

ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-

центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-

кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в

агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В

этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель

находится в логарифмической зависимости от длины последова-

тельности, что позволяет точно определить размер РНК

транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде

двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-

мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы

в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой

отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри-

дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то

преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо-

лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.

Кроме того, характер электрофоретического разделения позво-

ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень

низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях,

когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими

компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной

тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках

фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную

РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T

олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра-

цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со-

держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При

снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление

A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом

доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть

увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима

в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество

тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК

транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб-

ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для

переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так

и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп-

лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана-

лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для

анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения

направления транскрипции и картирования интронов.

Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети-

ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек-

тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа-

да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди-

намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино-

мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип-

цию.

Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер-

вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием

искусственным образом сконструированных транскрипционных

систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;

Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для

этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом

случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы

используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с

добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три-

фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради-

оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК

оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово-

дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее

описанных методов анализа мРНК, используют немеченые

кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим

достоинством этой транскрипционной системы является ее

максимальная приближенность к естественным процессам. При

втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен-

тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и

регуляторных белков.

Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе-

мы.

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и

посттрансляционных модификаций белков основаны на использо-

вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати-

ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-

жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино-

кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга

белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав-

ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез

соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении

меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки

после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова-

ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,

при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,

для значительного числа моногенных наследственных заболева-

ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова-

тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими-

ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного

содержания и отсутствия эффективных методов выделения и

очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от-

носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными

структурами клеток.

ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу-

ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным

средством анализа структуры, функции и синтеза белков

(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно-

ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь-

ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива-

ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень

экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов

инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин-

женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч-

но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,

в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу

рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях

экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге-

нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию

чужеродных белков в клетках.

Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль-

ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и

экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих

систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные

системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким

уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и

их используют, обычно, для производства большого количества

чистого белка, необходимого для получения антител или для

фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе-

ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем

сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь-

ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му-

тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи-

мости различных участков белка.

Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет-

ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем

в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют

ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти-

ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее

использовать для изучения посттрансляционных модификаций

белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп-

тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо-

ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения

дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую-

щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может

быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить

его в кристаллической форме и исследовать пространственную

структуру и функциональное назначение отдельных доменов

(Хэймс, Хиггинс, 1987).

Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко-

дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см.

Глава II). После секвенирования кДНК можно, исходя из гене-

тического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и

произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных

последовательностей в составе белков с уже известной струк-

турой и функциями. Выявление родственных белков, близких по

своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег

чает дальнейший молекулярный анализ функционирования иссле-

дуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность

белка позволяет прогнозировать его третичную структуру,

идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость

целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным

практическим следствием этих данных является также возмож-

ность получения антител к строго специфичным участкам бел-

ка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохими-

ческий и молекулярно-генетический. В первом случае для имму-

низации используют искусственно синтезированные полипептиды,

которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).

Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 амино-

кислот - они не могут быть очень большими из-за высокой сто-

имости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором

подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный

вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В резуль-

тате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в

котором наряду с аминокислотной последовательностью селекти-

руемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемо-

го белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации

животных и получения моновалентных или моноклональных анти-

тел. При наличии антител могут быть применены различные им-

мунологические подхооды для анализа тканеспецифического и

Характеристики

Список файлов реферата