CBRR4293 (677223), страница 18

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 18)

гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то

экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть поли-

пептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а

часть цепи будет транслироваться в соответствии с информаци-

ей, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок мо-

жет быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного

белка либо с помощью антител к специфическим участкам, коди-

руемым чужеродной ДНК.

В последнее время большое распространение получило

клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе

преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе

плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда,

отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы

могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фа-

говых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей

способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами

и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной

ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клониро-

вания в прокариотических системах.

Векторы, пригодные для направленного переноса в эука-

риотические клетки, конструируют на основе прокариотических

или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в

клетках эукариот, а также используют различные эукариоти-

ческие вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аде-

ноассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка-

честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последова-

тельности, ответственные за начало репликации. Введение век-

торов в эукариотические клетки часто осуществляют путем

ко-трансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и

сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, вве-

денные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение

нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул -

эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК

в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последователь-

ности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и насле-

дуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).

Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со-

держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихро-

мосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial

yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векто-

ров, содержащих в своем составе известные центромерные и те-

ломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые

для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Та-

кие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК

размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар осно-

ваний.

Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки

хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как

уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные

клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осущест-

вляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс

введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется

трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий,

облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через

клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости

мембран используют два разных подхода. В первом случае про-

водят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными

растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных

мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,

DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае

используют краткосрочное физическое воздействие на клетки

для создания в мембранах микропор, проходимых для макромоле-

кул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным

электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и

т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетичес-

кой трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Воп-

росам молекулярного клонирования также посвящена обширная

литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Мани-

атис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.

Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи-

кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для

использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником

этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро-

ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или

скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в

зависимости от специфических особенностей этих последова-

тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных

перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате

рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде-

ленной из какого-либо специфического источника. В зависи-

мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые

библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис-

пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от-

дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК

-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль-

тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-

ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об-

ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её

разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.

Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-

тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте-

ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге-

нов, но также несмысловые внутригенные последовательности -

интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-

рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки

состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-

иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-

ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч

пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-

щихся последовательностей геномной ДНК человека получается

после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или

Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-

личество клонов с различными инсертированными фрагментами

ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-

мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в

одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные

библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -

10!6 различных клонов.

Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или

космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче

хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-

отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на

основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая

способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много

удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут

быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-

ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто

используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-

ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не

вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для

создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,

используется технология искусственных дрожжевых хромосом

-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)

фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-

нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-

ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных

ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или

космидных библиотеках.

Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на

фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными

ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека

сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).

Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают

на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-

зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-

зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.

Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие

чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры

и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят

их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-

ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-

тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-

тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на

рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-

зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК

последовательности, комплементарные зонду, или специфические

антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных

культурах производят именно в тех местах, где произошло по-

темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,

отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-

нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и

субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать

большие количества этой ДНК.

1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.

Следующими этапами анализа отобранного и клонированного

ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-

ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-

ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-

ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул

ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,

однако, определение нуклеотидной последовательности протя-

женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-

дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-

ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -

метод Сэнджера. В первом случае используют химическое

расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют

нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез

на заданном основании.

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так

как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-

го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-

руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют

секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-

нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-

ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-

ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного

участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную

смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,

один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-

рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют

один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов

- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на

место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.

Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-

щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и

тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-

ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-

ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-

рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов

может быть определен, а значит и определена локализация ди-

дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов

в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем

геле может быть определена первичная последовательность все-

го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте

этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.

Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК

в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет

назад оценивалась в 1$.

В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-

варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных

на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых

участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-

Характеристики

Список файлов реферата