Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИИ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

ДИПЛОМНАџЯ РАБОТА

АТФ индуцированное изменение внутриклетоЧной концентрации кальцияЯ в нейронах неокортекса крыс.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ академик Магура И.С.

КОНСУЛЬТАНТ к. б. н. Войтенко Н.В.

рецензент к.б.н. Исаев Д

ДИПЛОМНИК кругликов И.А.

Москва 1998

Оглавление

1. ÂÂÅÄÅÍÈÅ

2. ÎÁÇÎÐ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ

2.1 Ãîìåîñòàç êàëüöèßÿ â íåðâíûõ êëåòêàõ

2.1.1 Êàëüöèåâûå êàíàëû ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû

2.1.2 Êàëüöèåâûå áóôåðû

2.1.3 Êàëüöèåâûå êàíàëû ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà

2.1.4 Êàëüöèåâûå íàñîñû

2.1.5 Êàëüöèåâûå îáìåííèêè

2.1.6 Ñà²⁺-ñâÿçûâàþùèå îðãàíåëëû

2.2 Вëèßÿíèå ÀÒÔ íà êàëüöèåâûé ãîìåîñòàç

2.2.1 Ñòðîåíèå è ñâîéñòâà ÀÒÔ

2.2.2 Íîìåíêëàòóðà è ñóáêëàññèôèêàöèÿ ïóðèíîðåöåïòîðîâ.

2.2.3 Ð₁ ïóðèíîðåöåïòîðû.

2.2.4 Ð₂ ïóðèíîðåöåïòîðû

2.2.5 Ðåêëàññèôèêàöèÿ ïóðèíîðåöåïòîðîâ.

3. ÎÁÚÅÊÒ È ÌÅÒÎÄÛ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÉ

3.1 Ïîäãîòîâêà ïðåïàðàòà

3.2 Õàðàêòåðèñòèêè êàëüöèåâîãî çîíäà

3.3 Îêðàñêà ñðåçîâ ôëóîðåñöåíòíûì êðàñèòåëåì

3.4 Ñòðóêòóðà ýêñïåðèìåíòàëüíîé óñòàíîâêè äëÿß äâóõ-âîëíîâîãî èçìåðåíèÿ êîíöåíòðàöèè êàëüöèÿß

3.5 Ðàñòâîðû è ñìåíà ðàñòâîðîâ

4. ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÉ

5. ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ

6. ÂÛÂÎÄÛ

7. ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ

1.ВВЕДЕНИЕ

Молекула АТФ давно известна как повсеместно распространенный источник энергии для внутриклеточного метаболизма. Но ее свойства как нейротрансмитера были обнаружены сравнительно недавно. Сегодня уже не осталось никаких сомнений, что АТФ является нейротрансмитером в автономных нейромышечных соединениях, ганглиях и центральной нервной системе. К примеру, было показано, что АТФ вовлечена в генерацию болевых сигналов через Р2Х₁ и Р2Х₂ рецепторы. Однако роль и распределение пуринорецепторов в коре головного мозга и особенно в моторной коре до сих пор остается слабо изученной. Поэтому изучение механизмов действия АТФ в коре головного мозга представляет несомненный интерес. Мы изучали действие АТФ посредством измерения концентрации внутриклеточного кальция, - одного из найболее важных и универсальных регуляторов клеточных функций.

Цель работы состояла в изучении механизмов генерации АТФ - индуцированных внутриклеточных кальциевых сигналов в нервных клетках моторной коры.

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1Гомеостаз кальция в нервных клетках

Концентрация цитозольного кальция в эукариотических клетках регулируется трансмембранным транспортом и цитоплазматическим связыванием кальция. Движение ионов кальция через мембрану контролируется: 1) двумя семействами Са²⁺ каналов, как то: кальциевыми каналами плазмалеммы и кальциевыми каналами, расположенными в мембране эндо(сарко)плазматического ретикулума (ЭР или СР), которые формируют пути входа кальция в цитоплазму; 2) выводом кальция из цитоплазмы благодаря активности кальциевых насосов плазмалеммы и/или кальциевых обменников; и 3) аккумуляцией ионов кальция внутриклеточными кальциевыми депо и митохондриями. Последние служат системами кальциевого буфера, способными аккумулировать и накапливать ионы кальция, поддерживая таким образом гомеостаз кальция в цитоплазме.

2.1.1Кальциевые каналы плазматической мембраны

Нервные клетки экспрессируют различные типы кальциевых каналов плазмалеммы, которые могут быть активированы различными воздействиями. Основываясь на механизмы активации, кальциевые каналы могут быть разделены на несколько типов потенциал - управляемых и рецептор - управляемых каналов.

Потенциал - управляемые каналы вносят существенный вклад как в регуляцию входа кальция в цитоплазму, так и в нейрональный электрогенез. Белки, образующие кальциевые каналы, состоят из 5 субъедениц (a₁, a₂, b, g, d). Главная субъеденица a₁ формирует собственно канал и содержит места связывания для различных модуляторов кальциевых каналов. Было обнаружено несколько структурно различных a₁ субъедениц кальциевых каналов в нервных клетках млекопитающих (обозначенных как A, B, C, D и E). Функционально кальциевые каналы различных типов отличаются друг от друга активацией, кинетикой, проводимостью одиночного канала и фармакологией. В нервных клетках описано до 6 типов потенциал - управляемых кальциевых каналов (T-, L-, N-, P-, Q-, R- каналы). Активность потенциал - управляемых каналов плазмалеммы регулируется различными внутриклеточными вторичными посредниками и мембраносвязанными G-белками (33,26).

Второй важный путь потока ионов кальция через мембрану связан с активацией агонист - управляемых каналов. Многие агонист - управляемые каналы обладают значительной кальциевой проницаемостью при физиологических условиях. Такую кальциевую проницаемость обнаруживают нейрональные ацетилхолин(Ach)-управляемые, глутамат -управляемые (NMDA и AMPA/Каинат типы) и пуринорецепторы (10,18,49,34). Кроме кальциевых каналов плазмалеммы, управляемых внешними воздействиями, в эукариотических клетках было открыто также несколько типов кальциевых каналов, контролируемых внутриклеточными вторичными посредниками. В частности, IP₃-управляемые кальциевые каналы были обнаружены в нейронах Пуркинье мозжечка (34), а IP₄-управляемые кальциевые каналы - в клетках эндотелия (35).

Третий, недавно обнаруженный, особый тип Са²⁺ каналов, который контролируется заполненностью внутриклеточных кальциевых депо, осуществляя таким образом прямую связь между освобождением Са²⁺ в цитоплазму из депо и вход в нее Са²⁺ через плазмалемму.

2.1.2Кальциевые буферы

Большая часть ионов Са²⁺, входящих в клетку, практически немедленно связывается цитоплазматическими местами связывания кальция. Показано, что только менее 1% ионов кальция, которые проникают в цитозоль, остается в несвязанном состоянии (11). Цитозольные кальциевые буферы представлены главным образом Са²⁺-связывающими белками, такими как парвальбумин, кальмодулин, тропонин-С, кальретинин, кальциунеурин, белок S-100 (25). Кроме того, цитозольная буферная емкость может быть опосредована АТФ, которая способна связывать значительное количество Са²⁺ (64). 20-50% цитозольных кальциевых буферов могут быть удалены из цитоплазмы при перфузировании клетки, что показывает их мобильность, в то время как оставшаяся часть Са²⁺-связывающей емкости относится к фиксированным буферам. Мобильные кальциевые буферы могут играть важную функциональную роль, способствуя диффузии ионов Са²⁺ в цитоплазме и распространению Са²⁺ сигнала по клетке. Внутриклеточное введение эндогенных Са²⁺ буферов (кальбиндина D_28k и парвальбумина) через микропипетку приводило к увеличению скорости нарастания [Ca²⁺]_i на несколько порядков и существенно влияло на кинетику изменения [Ca²⁺]_i, что подтверждает роль мобильных Са²⁺ буферов с низким молекулярным весом в эффективном регулировании внутриклеточной концентрации кальция.

2.1.3Кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума

Са²⁺ каналы ЭР являются олигометрическими протеинами, встроенными в мембрану ЭР. Эти каналы можно относительно легко выделить из клетки для дальнейшего структурного анализа благодаря тому, что белки канала связываются специфически и с высоким сродством с IP₃ (для IP₃-управляемых каналов) и с рианодином (для Са²⁺-управляемых каналов).

Са²⁺-управляемые Са²⁺ каналы ЭР. Эти кальциевые каналы были впервые выделены из скелетных и сердечных мышц. Оказалось, что Са²⁺ каналы ЭР в этих мышечных тканях имеют молекулярные различия и закодированы различными генами. Са²⁺ каналы ЭР в сердечных мышцах непосредственно связаны с высокопороговыми Са²⁺ каналами плазмалеммы (L-тип) через кальцийсвязывающие белки, образуя, таким образом, функционально активную структуру - «триаду». В скелетных мышцах деполяризация плазмалеммы прямо активирует освобождение Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума благодаря тому, что Са²⁺ каналы плазмалеммы служат потенциал - чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно Са²⁺ каналам ЭР через связывающие белки (44). Таким образом, Са²⁺ депо скелетных мышц обладают механизмом освобождения Са²⁺, вызываемым деполяризацией (RyR1-тип). В отличие от скелетных мышц, саркоплазматические Са²⁺ каналы кардиомиоцитов не связаны с плазмалеммой, и для стимуляции освобождения Са²⁺ из депо требуется увеличение концентрации цитозольного кальция (RyR2-тип). ДНК, кодирующая белки двух типов каналов Са²⁺ освобождения, была клонирована из тканей человека и кролика, что дало возможность экспрессировать Са²⁺-управляемые Са²⁺ каналы в модельные клеточные системы. Белки, встроенные в липидный бислой, формируют чувствительные к рианодину каналы, активируемые ионами Са²⁺ (50 нмоль/л) в присутствии АТФ (29). Кроме этих двух типов Са²⁺-активируемых Са²⁺ каналов, недавно был идентифицирован третий тип Са²⁺ каналов ЭР (RyR3-тип), который является продуктом другого гена. Этот третий тип Са²⁺ каналов ЭР, как было показано, не чувствителен к кофеину (21). Эксперименты, проведенные на нервных тканях, продемонстрировали присутствие всех трех типов Са²⁺-управляемых Са²⁺ каналов ЭР в мозге млекопитающих, однако RyR2-тип является доминантным (38). Са²⁺-управляемые Са²⁺ каналы ЭР являются гомотетрамерами, состоящими из мономеров с молекулярным весом 500 КД (39)

IP₃-управляемые Са²⁺ каналы ЭР. Существование IP₃-управляемых Са²⁺ каналов впервые было обнаружено в нейронах Пуркинье. Позже было показано, что они встроены в мембрану эндоплазматического ретикулума. Структура IP₃-управляемых Са²⁺ каналов сходна со структурой Са²⁺-управляемых Са²⁺ каналов ЭР. Они также являются гомотетрамерами с молекулярным весом мономера 260 КД. 50% этих каналов активируется 15 мкмоль/л IP₃ и блокируется рутением красным и La³⁺. IP₃-управляемые Са²⁺ каналы были выделены из мозга млекопитающих, и их аминокислотная последовательность была расшифрована. Было показано, что семейство генов, экспрессирующих IP₃-управляемые Са²⁺ каналы, состоит из трех или четырех различных генов; они характеризуются различной чувствительностью к IP₃ и по-разному распределены в мозге млекопитающих (45). Порог активации этих каналов варьирует между 0.2 - 0.5 мкмоль/л в нейронах Пуркинье мозжечка и возрастает до 9 мкмоль/л в астроцитах.

2.1.4Кальциевые насосы

Существует два семейства Са²⁺ насосов, ответственных за устранение ионов Са²⁺ из цитоплазмы: Са²⁺ насосы плазмалеммы и Са²⁺ насосы эндоплазматического ретикулума. Хотя они относятся к одному семейству белков (так называемому P-классу АТФ-аз), эти насосы обнаруживают некоторые различия в строении, функциональной активности и фармакологии.

Кальциевый насос плазмалеммы. Са²⁺ насос плазмалеммы, который удаляет ионы Са²⁺ из цитоплазмы в межклеточное пространство, был открыт в 1966 году. Молекулярные свойства Са²⁺ насосов плазмалеммы описаны в нескольких обзорах (18), однако достоверных данных о скорости вывода Са²⁺ и регуляции Са²⁺ насосов в нервных клетках немного. Недавно был разработан двухфлуоресцентный микрокапельный метод (58), позволяющий одновременно измерять [Ca²⁺]_i и выход Са²⁺ наружу на одиночных клетках. Исследования, проведенные с помощью данного метода на нейронах моллюска и секреторных клетках, показали, что активность Са²⁺ насоса плазмалеммы контролируется непосредственно [Ca²⁺]_i: увеличение концентрации цитоплазматического кальция активирует Са²⁺ насос (58). В нейронах моллюска около 40% ионов кальция, входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны, выводится из нейрона уже во время фазы нарастания [Ca²⁺]_i, отражая таким образом активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации цитозольного Са²⁺ (58).

Характеристики

Тип файла документ

Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.

Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.

Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.

Список файлов реферата