166423 (625009), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) стала сейчас важным способом ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора с относительно малым фоновым сигналом и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и APCI, поток жидкости для APPI (рис. 1.13) вводится прямо в устройство ионизации.

Основное различие между APCI и APPI состоит в том, что в APPI парообразный образец проходит через ультрафиолетовый свет (обычная криптоновая лампа испускает от 10.0 эВ до 10.6 эВ). Часто APPI является намного более чувствительным, нежели ESI или APCI и показывает более высокое соотношение сигнал/шум из-за более низкой ионизации фона. Низкий сигнал фона во многом обусловлен высоким потенциалом ионизации стандартных растворителей, таких, как метанол и вода (10.85 и 12.62 эВ, соответственно), которые не ионизируются криптоновой лампой.

Недостатком ESI и APCI является то, что они образуют фоновые ионы растворителей. В дополнение к этому, ESI особенно подвержен эффектам подавления ионов, а APCI требует испарения при температурах 350-500°C, что может вызвать термическое разложение.

APPI производит ионизацию двумя механизмами. Первый – простое фотовозбуждение, инициирующее испускание электрона с образованием молекулярного катион-радикала (M⁺). APPI устройство воздействует светом с энергией выше, чем потенциалы ионизации (ИП) большинства целевых молекул, но ниже, чем ИП для большинства молекул растворителей и воздуха, тем самым исключая их как помехи. К тому же, из-за малой избыточной энергии, сообщаемой молекулам, достигается минимальная фрагментация.

Второй механизм – фотоиндуцированная химическая ионизация при атмосферном давлении, которая похожа на APCI в том, что она включает перенос заряда при протонировании (MH⁺) или потере протона ([M-H]^-).

Для инициирования химической ионизации фотоионизирующийся реагент добавляется к элюенту. После фотоионизации реагента происходит перенос заряда на аналит. Типичными реагентами для положительной ионизации являются ацетон и толуол. Ацетон также служит реагентом для отрицательной ионизации.

Механизм ионизации (M⁺ или [M+H]⁺), который претерпевает молекула, зависит от сродства к протону аналита, растворителя и типа используемого дополнительного реагента.[9]

Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы (MALDI)

Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы (MALDI-MS) впервые была использована в 1988 году Танакой, Карасом и Хилленкампом. С тех пор он стал широко распространённым методом для пептидов, белков и большинства других биомолоекул (олигонуклеотидов, углеводов, природных веществ и липидов). Эффективный и направленный перенос энергии во время акта индуцированной лазером десорбции при помощи матрицы приводит к большому выходу ионов незатронутого аналита и позволяет проводить измерения соединений с субпикомолярной чувствительностью. Вдобавок, удобство MALDI для анализа гетерогенных образцов делает его очень привлекательным для масс-анализа сложных биологических образцов, как, например, гидролизат белков.

Хотя точный механизм десорбции/ионизации для MALDI неизвестен, принято считать, что MALDI вызывает ионизацию и перевод образца из конденсированной фазы в газовую посредством лазерного возбуждения и индивидуализации молекул образца из матрицы (рис. 1.14). В MALDI анализе аналит сначала сокристаллизуется с большим молярным избытком матричного соединения, обычно УФ-поглощающей слабой органической кислотой. Облучение такой смеси аналита с матрицей лазером приводит к испарению матрицы, которая несёт аналит в себе. Матрица играет ключевую роль в этом методе. Сокристаллизованные молекулы образца также испаряются, но без прямого поглощения энергии лазера. Молекулы, чувствительные к лазерному излучению, поэтому защищены от прямого возбуждения УФ-лазером.

Матрица MALDI – нелетучий твёрдый материал, обеспечивающий процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения. Как результат, и матрица, и любой образец, встроенный в неё, испаряются. Матрица также служит для того, чтобы минимизировать ущерб образцу от лазерного излучения, поглощая большую часть падающей энергии.

Оказавшись в газовой фазе, десорбированные заряженные молекулы затем электростатически направляются из MALDI устройства ионизации в масс-анализатор. Времяпролётные (TOF) масс-анализаторы часто используются для разделения ионов по отношению массы к заряду (m/z). Импульсная природа MALDI очень удобна для TOF анализаторов, т.к. начальный момент времени можно засекать как момент лазерного импульса.

Было разработано несколько теорий для объяснения десорбции посредством MALDI. Модель термических пиков предполагает, что выброс неповреждённых молекул обусловлен слабым колебательным взаимодействием между матрицей и аналитом, что минимизирует перенос колебательной энергии от матрицы к модам молекул аналита, тем самым минимизируя фрагментацию. Теория импульсного давления предполагает, что создаётся градиент давления, перпендикулярный поверхности, и десорбция больших молекул вызвана передачей импульса при их столкновениях с быстро движущимися молекулами матрицы. Обычно считается, что ионизация происходит посредством передачи протона или катионизации во время процесса десорбции.

Полезность MALDI для анализа биомолекул основана на её способности давать информацию о молекулярном весе неповреждённых молекул. Способность давать точную информацию может быть чрезвычайно важна для определения и характеристики белков. Например, белок часто может быть однозначно определён точным анализом масс составляющих его пептидов (полученных химическим или же ферментативным воздействием на образец).[4]

Приготовление образца и матрицы оказывает значительное влияние на качество масс-спектров MALDI белков и пептидов (рис. 1.15). Среди большого разнообразия известных методов приготовления наиболее часто употребляемым является метод высушенной капли. В этом случае насыщенный раствор матрицы смешивается с раствором аналита так, чтобы соотношение матрицы к аналиту было около 5000:1. Аликвота (0.5-2.0 мкл) такой смеси затем помещается на место образца, где затем высушивается. Ниже приведена методика такого приготовления:

• отобрать пипеткой 0.5 мкл образца на подложку;

• отобрать пипеткой 0.5 мкл матрицы на подложку;

• перемешать образец и матрицу втягиванием их в пипетку и выпусканием;

• позволить высохнуть на воздухе.

• Для пептидов, небольших белков и большинства других соединений: насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с 0.1% ТФА.

• Для белков и других тяжёлых молекул: насыщенный раствор синапиновой кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с добавлением 0.1% ТФА.

• Для гликопептидов/белков и маленьких соединений: насыщенный раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в 50:50 ацетонитрил:вода.

Рис. 1.15. Обычно используемые в MALDI матрицы и подложка для MALDI с показанным расположением матрицы. Одним из преимуществ MALDI является то, что множество образцов может быть подготовлено в одно и то же время, как видно по этой многообразцовой подложке.

Также образцы могут быть приготовлены последовательным способом. В тонкослойном методе сначала на цель наносится гомогенная «плёнка» матрицы, а затем туда добавляется образец, который абсорбируется ей. Этот метод даёт хорошую чувствительность, разрешающую способность и точность определения. Аналогично, в толстослойном методе нитроцеллюлоза (NC) используется как добавка к матрице. После образования единого слоя NC-матрица на цели добавляется образец. Этот метод приготовления предотвращает образования щелочных аддуктов и значительно увеличивает чувствительность определения, особенно для пептидов и белков, экстрагированных из гелей. Сэндвичевый метод – другой вариант в этой категории. Тонкий слой кристаллов матрицы приготовляется как в тонкослойном методе, затем последовательно добавляются капли (a) водного 0.1% ТФА, (b) образца и (c) матрицы.

Десорбция/ионизация на кремнии (DIOS)

DIOS – свободный от матрицы метод, который использует импульсную десорбцию/ионизацию на кремнии (рис. 1.16). Поверхности структурированного кремния, такого, как пористый кремний или кремниевое нановолокно являются УФ-поглощающими полупроводниками с большой площадью поверхности (сотни м²/см³). При применения в масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией, строение структурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул растворителя и аналита, а поглощение УФ даёт механизм для передачи энергии лазера аналиту. Такая удачная комбинация свойств позволяет DIOS быть применимым для большого разнообразия биомолекул, включая пептиды, углеводы и небольшие органические соединения различных типов. В отличие от других прямых безматричных методов десорбции DIOS позволяет проводить десорбцию/ионизацию с малым разложением аналита или вообще без него.

DIOS сильно связан с MALDI. Оборудование для DIOS-MS требует только незначительной настройки для использования в MALDI; чип просто закрепляется на обработанной MALDI-подложке и вставляется в масс-спектрометр. Та же длина волны лазера (337 НМ), обычно применяемая в MALDI, подходит и для DIOS. Хотя DIOS сравним с MALDI в отношении чувствительности, у него есть несколько преимуществ из-за отсутствия мешающей матрицы: низкий фон на малых диапазонах массы, такое же размещение водных образцов, упрощённая подготовка образцов. Вдобавок, компоновка в чипах легко адаптируется к автоматической подготовке образца, при которой лазер быстро обрабатывает чип, переходя от одного участка к другому. DIOS может, таким образом, ускорить и упростить крупные анализы соединений с низкой молекулярной массой, так же, как MALDI для макромолекул. Так как массы многих низкомолекулярных соединений могут быть легко измерены, DIOS-MS применим для анализа превращений малых молекул, как ферментативных, так и химических. [3]

Бомбардировка быстрыми атомами/ионами (FAB)

Бомбардировка быстрыми атомами/ионами, или FAB – метод ионизации, схожий с MALDI, так как в нём используется матрица и пучок высокоэнергетических частиц для десорбции ионов с поверхности. Важно, однако, обозначить различия между MALDI и FAB. В MALDI, энергетический пучок представляет собой импульсный лазерный свет, в то время как FAB использует непрерывный пучок ионов. В MALDI матрица обычно твёрдая кристаллическая, а в FAB обычно использует жидкую матрицу. Также нужно отметить, что FAB примерно в 1000 раз менее чувствителен, нежели MALDI.

Характеристики

Список файлов курсовой работы