166423 (625009), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Суть ESI заключается в следующем. Электрическое напряжение на игле приводит к большому электрическому градиенту на жидкости, который разделяет заряды на поверхности. Это вынуждает жидкость выпячиваться с иглы в форме конуса Тейлора. Верхушка конуса вытягивается в нить до тех пор, пока не достигнет предела Рэлея, при котором поверхностное натяжение и электростатическое отталкивание сравняются и сильно заряженная капля не оторвётся от нити. Капли, которые оторвались от конуса, притягиваются к входу в масс-спектрометр из-за большой разности потенциалов между иглой и входом в масс-анализатор. По мере продвижения капли к анализатору кулоновское отталкивание на поверхности превосходит поверхностное натяжение и капля «взрывается», окончательно высвобождая ионы.[3]

И
онизация электроспрея – метод, который обычно применяется для пептидов, белков, углеводов, малых олигонуклеотидов, синтетических полимеров и липидов. ESI производит газообразные заряженные молекулы прямо из жидкого раствора. Ионизация происходит при создании тонкого спрея сильно заряженных капель в присутствии электрического поля. Образец раствора распыляется из области с сильным электрическим полем на конце металлической форсунки, поддерживаемой при потенциале между 700 и 5000 В. Форсунка (или игла), к которой приложен потенциал, служит для распыления раствора в тонкий спрей заряженных капель. Использование сухого газа, нагревания или оба этих способов применяется к заряженным каплям при атмосферном давлении для испарения из них растворителя. С уменьшением размера капель возрастает плотность заряда на их поверхности. Взаимное кулоновское отталкивание между одинаковыми зарядами на этой поверхности становится настолько велико, что превосходит силы поверхностного натяжения и ионы вырываются из капли через «конус Тейлора» - рис. 1.5. Другая возможность состоит в том, что капля взорвётся, высвобождая ионы. В любом случае свободные ионы направляются в канал через электростатические «линзы», направляясь в вакуум масс-анализатора. Так как ESI включает в себя непрерывную подачу раствора, он применим для использования совместно с ВЭЖХ или капиллярным электрофорезом.[4]

И
онизация электроспрея благоприятствует образованию единично заряженных малых молекул, но также хорошо известно образование в ходе неё многократно заряженных экземпляров больших молекул. Это важное явление, т.к. масс-спектрометр измеряет отношение массы к заряду (m/z) и поэтому многократная зарядка делает возможным наблюдать очень большие молекулы при помощи инструмента с относительно малым диапазоном масс. К счастью, программы, пригодные для всех масс-спектрометров с электроспреем, позволяют произвести вычисления молекулярной массы, необходимые для определения действительной массы многозарядных образцов. Рис. 1.6 и 1.7 показывают различные заряженные состояния двух различных белков, где каждый пик в масс-спектрах может быть соотнесён с различными зарядовыми состояниями молекулярного иона. Многократная зарядка имеет другие важные преимущества в тандемной масс-спектрометрии. Одно из преимуществ состоит в том, что после фрагментации вы наблюдаете больше фрагментарных ионов от многозарядного предшественника, чем от однозарядного.

М
ногократная зарядка: белок с массой 10000 дальтон и его теоретический масс-спектр с зарядами до +5 показаны на рис. 1.8. Масса белка остаётся такой же в то время, как отношение m/z меняется в зависимости от числа зарядов на белке. Ионизация белка есть обычно результат протонирования, что не только добавляет заряд, но также увеличивает массу белка на число добавленных протонов. Это действие на m/z применимо одинаково для любого механизма ионизации молекулы, образовавшего положительно или отрицательно заряженный молекулярный ион, включая присоединение или отрыв несущих заряд частиц, отличных от протона (например, Na⁺ и Cs⁺). Многократные положительные заряды наблюдаются для белков, в то время как для олигонуклеотидов типично образование отрицательных зарядов (с ESI).

Х
отя масс-спектрометры электроспрея снабжены программами, которые подсчитывают молекулярный вес, понимание, как компьютер производит эти вычисления для многократно-заряженных ионов полезно. Уравнения 1.1 – 1.5 и рис. 1.9 представляют простое объяснение, где мы принимаем, что пики p1 и p2 являются соседними и различаются одним зарядом, что эквивалентно добавлению одного протона.

Растворители для электроспрея

Многие растворители могут быть использованы в ESI и выбираются в зависимости от растворимости исследуемых соединений, летучести растворителя и способности растворителя к отдаче протона. Обычно, основными являются протонные растворители, такие, как, метанол, 50/50 метанол/вода или 50/50 ацетонитрил/вода, в то время как апротонные сорастоврители, такие, как 10% ДМСО в воде, а также изопропиловый спирт, используются, чтобы улучшить растворимость для некоторых соединений. Хотя 100% вода и используется в ESI, её относительно низкое давление пара является определяющим фактором чувствительности; лучшая чувствительность получается при добавлении летучего органического растворителя. Некоторые соединения требуют использования чистого хлороформа с добавлением 0.1% муравьиной кислоты для обеспечения ионизации. Такой подход, хоть и менее чувствительный, может быть эффективен для соединений, не растворимых другим образом.[5]

Буферы, такие, как Na⁺, K⁺, фосфат и соли представляют проблему для ESI из-за снижения давления пара капель, ведущего к ослаблению сигнала из-за увеличения поверхностного натяжения капель, ведущего к уменьшению летучести. Поэтому летучие буферы, такие, как ацетат аммония, могут быть использованы более эффективно.[6]

Устройство прибора ионизации электроспрея

Неосевая конфигурация ESI, которая сейчас используется во многих приборах для введения ионов в анализатор (как показано на рис. 1.10), показала себя очень эффективной при использовании с большим потоком жидкости. Основное преимущество такой конфигурации состоит в том, что скорость потока может быть увеличена без засорения или закупоривания входного отверстия. Неосевое распыление важно, потому что вход в анализатор более не насыщается растворителем, тем самым предохраняя капли от попадания во входное отверстие и его загрязнения. Наоборот, только ионы направляются ко входу. Это делает ESI ещё более совместимым с ЖХ при скоростях до мл/мин.

Ионизация наноэлектроспрея (nanoESI)

Э
лектроспрей низкого потока, впервые описанный Вильмом и Манном, называли наноэлектроспреем, наноспреем и микроэлектроспреем. Такой способ ионизации является вариацией ESI, в которой игла спрея сделана очень

маленькой и расположена близко ко входу в масс-анализатор (рис. 1.11). Конечным результатом такой простой корректировки становится увеличение эффективности, которое включает уменьшение необходимого количества образца.

Скорости потока для nanoESI обычно составляют ль десятков до сотен нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, nanoESI использует источники из вытянутого и, в некоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворённый образец вносится в источник и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Также, источники расположены очень близко ко входу в масс-анализатор, поэтому перенос ионов в масс-анализатор намного более эффективен. Например, анализ 5 mM раствора пептида при помощи nanoESI займёт одну минуту, употребив ~50 фемтомоль образца. Такой же эксперимент с обычным ESI за то же время израсходует 5 пикомоль, т.е. в 100 раз больше, чем nanoESI. К тому же, так как капли для nanoESI обычно меньше, чем для обычного ESI (рис. 1.11.), необходимое для образования ионов испарение намного меньше. Следовательно, nanoESI менее чувствительно к солям и другим примесям, т.к. меньшее испарение означает, что примеси не будут концентрироваться так сильно, как при ESI.[7]

Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)

A
PCI также стала важным способом ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и в электроспрее, поток жидкости для APCI (рис. 1.12) вытекает непосредственно в устройство ионизации.

Однако сходство здесь заканчивается. Капли не заряжаются и APCI устройство содержите нагретый испаритель, который обеспечивает быстрое разделение/испарение капель. Молекулы образца в паре проходят через зону ионно-молекулярной реакции при атмосферном давлении.

В APCI ионизация возникает из-за возбуждения/ионизации растворителя коронным разрядом. Т.к. ионы растворителя существуют при атмосферном давлении, химическая ионизация молекул аналита очень эффективна; при атмосферном давлении молекулы аналита сталкиваются с ионами реагента очень часто. Перенос протона (для реакций протонирования MH⁺) образует положительные ионы, а перенос электрона или отщепление протона ([M-H]^-) даёт отрицательные. Сглаживающее влияние сольватных оболочек на ионах реагента и высокое давление газа уменьшают фрагментацию во время ионизации и ведут к образованию практически только нетронутых молекулярных ионов. Многократная зарядка обычно не наблюдается, скорее всего, потому что процесс ионизации более энергичен, чем при ESI.[8]

Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)

Характеристики

Список файлов курсовой работы