Диссертация (1173246), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Исследование проводилось, лёжа на спине, с выпрямленными ногами. Перед началом исследования во влагалище вводили полостнойэлектрод. Поскольку прибор имел еще четыре накожных электрода, два фиксировали к ягодицам пациентки, два на кожу живота, на 2–4 см ниже пупка, справа ислева от средней линии. Накожные электроды фиксировали мышечные сокращения ягодиц и мышц брюшного пресса и отображали их на экране наряду с сокращениями мышц промежности, что позволяло пациенткам дифференцировать работу мышц тазового дна и «посторонних» мышц («не тазового дна»), и, как следствие, выполнять упражнения правильно. С помощью электромиографии былиоценены следующие параметры: Максимальное сокращение мышцы (мВ), усред12ненное сокращение (мВ), минимально расслабление или базовый тонус (мВ), усредненное расслабление (мВ), а также так называемый тест на утомляемость, тоесть время удержания мышечного сокращения (сек).
Далее всем пациенткам поспециально разработанной программе предлагали попеременно сокращать и расслаблять мышцы тазового дна. Компьютерная программа электромиографа предлагала различные по длительности и силе комбинации сокращения и расслабления мышц, которые пациентка видела на экране аппарата в форме графика истремилась поэтапно выполнять. Объективизацию силы и длительности мышечного сокращения проводили на основании специальной электромиографическойкомпьютерной программы. Перинеометрическое исследование, а также обучениепациенток ТМТД было выполнено в физиотерапевтическом отделении Клинического госпиталя Лапино «Мать и дитя», (гл.
врач Спиридонова Е.И.) [20].Сонографическая диагностикаВсем пациенткам было выполнено трансвагинальное (для исключения опухолей органов малого таза) и трансперинеальное сонографическое исследованиена аппарате Voluson E8 Expert с использованием высокочастотного внутриполостного датчика с частотами сканирования 4,5–11,9 МГц 4D (General Electric,США).
Исследования проводились в положении пациентки лежа на спине, с согнутыми в коленях и разведенными ногами. Опорожнение мочевого пузыря передисследованием проводить не рекомендовалось, поскольку оптимальным было наличие в мочевом пузыре приблизительно150 мл мочи, которое, при ненарушеннойфункции почек, образуется в среднем за 1,5–2,0 часа. Исследование начинали странсперинеальных характеристик тазового дна, чтобы не вызвать смещенияструктур передней стенки влагалища [30].
С помощью сонографического исследования тазового дна оценивали следующие параметры: высоту сухожильногоцентра, толщину m. bulbocavernosus, диастаз ножек леваторов, толщину m.puborectalis, площадь сечения m. bulbocavernosus, толщину промежности, наличиеили отсутствие асимметрии сухожильного центра, а также его деформацию.13Анатомическим ориентиром при продольном сканировании служило лонноесочленение (лонный угол), а при поперечном — анальное отверстие и уровеньвхода во влагалище «introitusvagina».
Сухожильный центр промежности определялся в виде гипоэхогенной структуры между задней стенкой влагалища и передней стенкой прямой кишки. Измерение высоты сухожильного центра проводиливертикально, от верхнего края наружного анального сфинктера до слизистой влагалища.Толщину m. bulbocavernosus измеряли в поперечном сечении, в плоскости,проходящей через верхний край наружного анального сфинктера. В норме толщина m.
bulbocavernosus составляет более 15 мм, а при выраженной НМТД — менее 0,5 см [30]. Помимо толщины луковично-пещеристой мышцы, измеряли площадь ее сечения, которая в норме должна составлять 2,0–2,4 см2, а при недостаточности уменьшается вплоть до 1,2 см2. Сонографически определяли толщину m.puborectalis, состоящую из двух пучков, расходящихся симметрично вверх от заднего края наружного анального сфинктера. За норму принимали эхографическуютолщину мышцы от 7 мм.
Заключительным этапом сонографического исследования была оценка толщины промежности- расстояния от кожи промежности дозадней стенки влагалища, — в норме не менее 11 мм [16]. Таким образом, дажеодин из изложенных выше сонографических показателей, находящийся вне нормативных значений, трактовали как признак НМТД [30]. Ультразвуковое исследование проводилось на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии скурсом перинатологии Медицинского института Федерального Государственногоавтономного образовательного учреждения высшего образования (МПК МРФГАОУ ВО) «Российский университет дружбы народов» (зав. кафедрой — членкорр.
РАН, засл. деятель науки РФ, д.м.н., проф. Радзинский В.Е.).Оценка качества жизни и сексуальной функцииДля изучения влияния НМТД на качество жизни пациенток нами был выбран опросник ВОЗКЖ-26 (Приложение 1), характеризующий несколько сфержизни: физическое и психическое благополучие, самовосприятие, микросоциаль14ная поддержка, социальное благополучие. Согласно ответам, полученных в ходеанкетирования пациентки набирали то или иное количества баллов, характеризующих разные стороны качества жизни, затем баллы суммировали и рассчитывали общий показатель качества жизни.Для изучения сексуальной функции использовали опросник: Индекс женской сексуальности — Female Sexual FunctionIndex (FSFI) (Приложение 2) [75,99].
Опросник позволял оценить сексуальную функцию за месяц и состоит из 19вопросов по 6 аспектам половой жизни: характер сексуального возбуждения, половое влечение; любрикация; оргазм; удовлетворенность сексом; боль при половом акте. Каждый из вышеописанных пунктов опросника состоял из 2–4 вопросов, ответы на которые соответствуют баллам (от 0 до 5). В дальнейшем баллысуммировались. Максимальный результат считали при — 36 баллах, минимальный — при 2 баллах.
Индекс менее 26,5 указывал на наличие сексуальной дисфункции [99]. Также для оценки сексуальной функции был использован опросникPISQ-12 (Приложение 3). Опросник был составлен профессором Ребеккой Роджерс в 2002 году, и включает в себя три домена, характеризующих поведенческую/эмоциональную сферу, физические аспекты половой жизни и вопросы отношений с партнером. PISQ-12 — это сокращенный вариант PISQ, который быладаптирован для использования в клинической работе и достаточно полно отражает состояние проблемы. Пункты опросника оценивались в баллах согласношкале Ликерта и содержат 5 вариантов ответа от «никогда» — 0 баллов, до «всегда» — 5 баллов.
Для оценки сексуальной функции суммировали все баллы, максимальное количество — 48, что свидетельствовало об удовлетворительной сексуальной функции [51]. Также для оценки сексуальной функции пациенток использовали индекс оргастичности — показатель частоты наступления оргазма впроцентном соотношении к общему количеству половых актов женщины за определенный период времени.Морфологическое исследование15Для выяснения патогенетических аспектов НМТД было выполнено морфологическое исследования биоптатов ткани передней и задней стенок влагалища,полученных методом пункционной биопсии в фазу ранней пролиферации (5–7-йдни менструального цикла), с помощью методов световой микроскопии, иммуногистохимии (ИГХ).
Также было проведено молекулярно-биологическое исследование с помощью ПЦР-диагностики. Первым этапом было проведено сравнение спомощью всех вышеуказанных методов стенки влагалища женщин с НМТД и пациенток без симптомов НМТД (n = 10), ткани которых были получены при хирургическом вмешательстве по поводу кист и перегородок влагалища; вторым этапомбыло проведено сравнение результатов женщин до и после лечения. Важными условиями при признании биопсии стенки влагалища удовлетворительной были получение всей толщины его стенки (всех трех оболочек), обязательное присутствиемышечного и фасциального компартментов (их наличие подтверждали гистологически).
Биопсийный материал до и после курса лечебных процедур подвергалиморфологическому и ИГХ исследованиям с проведением компьютерной морфометрии, а также исследованию методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦРРВ).Морфологическое исследование производили методом световой микроскопии после подготовки биоптатов согласно стандартной методике (фиксация, проводка, окрашивание, заключение). ИГХ исследование выполняли после депарафинизации и регидратации парафиновых срезов по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max (Leica, Великобритания).
В качестве первичных антител использовали мышиные антитела (Abcam,Великобритания) к коллагену I типа (Anti-Collagen I antibody, Clone abab138492,1:500), коллагену III типа (Anti-Collagen III antibody, Clone ab23445, 1:750), α-SMA(Anti-alpha smooth muscle Actin antibody, Clone ab7817, 1:200). Вторичные антитела — универсальные Cell Marque (США).
Для каждого маркера выполняли контрольные исследования для исключения псевдопозитивных и псевдонегативныхрезультатов. Титр антител подбирали с использованием раствора для разведения16антител (antibody diluents). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Mayer,промывали под проточной водой, дегидратировали (спирт 96%), заключали подпокровные стекла.
Интенсивность ИГХ окрашивания срезов оценивали при помощи 3-балльной шкалы: 1 — слабое окрашивание, 2 — умеренное, 3 — выраженное.Учитывая биохимические особенности и характер расположения окрашиваемых структур (коллагены), определяли соотношение их распределения в собственной пластинке слизистой оболочки и суммарное содержание во всех оболочках стенки влагалища.
Визуализацию биопсийного материала выполняли на светооптическом микроскопе Carl Zeiss Lab.A1 (Carl Zeiss, Германия), совмещенномс видеокамерой AxioCam ERc5s (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) и программным обеспечением ZEN Lite. Компьютерную морфометрию для оценки результатов ИГХ реакции и для определения площади позитивно окрашенных объектов в поле зрения осуществляли при помощи компьютерной системы анализаизображения с открытым кодом Image J 1.51.
Для этого проводили микрофотосъемку 10 случайно отобранных полей зрения при 200-кратном увеличении намикропрепаратах после выполненной ИГХ реакции с соответствующими первичными антителами.Далее полученное изображение автоматически подвергали нормализации ипереводили из режима цветной 24-битной картинки (RGB) в режим 256 градацийсерого (gray scale), выполняли бинаризацию объектов с заданным уровнем чувствительности. При обработке микрофотографий системой анализа изображенийотсекали бинарные объекты с уровнем яркости более 150 и определяли суммарную площадь позитивно окрашенных объектов в процентном соотношении отобщей площади микрофотографий, которые были выполнены на клинической базе кафедры патологической анатомии имени академика А.И.
Струкова ФГАОУВО Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М.Сеченова (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Коган Е.Ф.) при непосредственном участии доцента кафедры к.м.н. Демяшкина Г.А., а также в лаборатории молекуляр17ной биологии №9 Лечебно-диагностического центра Московской области (зав.лабораторией к.м.н. Мудров В.П.).Молекулярно-биологические методы исследованияПЦР-РВ была выполнена для определения экспрессии MMP-1, MMP-2,MMP-3, MMP-9, PDGF-β и TNXB во фрагментах стенок влагалища до и после лечения.
Фрагменты биоптатов стенок влагалища были помещены в стабилизирующий раствор RNAlater (QIAGEN, Нидерланды) и хранились при температуре –70°C. Экстракцию тотальной РНК производили с использованием набора готовыхреактивов RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Нидерланды).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
