Э. Рис, М. Стернберг - Введение в молекулярную биологию от клеток к атомам (1160049), страница 16
Текст из файла (страница 16)
ред.32РО4 с помощью фермента полинуклеотидкиназы.Затем ДНК обрабатывают соответствующими реагентами, расщепляющими эту цепь около определенных оснований. Такое расщепление проводят входе четырех параллельных реакций в условиях,когда разрыв происходит после А в одной из реакций,после G в другой, после С в третьей и после С и Т вчетвертой. Условия реакций таковы, что получаютсясмеси, содержащие фрагменты всевозможной длины,отсчитываемой от меченого 5'-конца до каждой точкицепи, где находится данное основание. Например,если G находится в положениях 1, 5, 7 и 19 вофрагменте из 20 оснований, то одна из смесей,полученных в ходе деградации, будет содержать радиоактивные фрагменты длиной 5, 7 и 19 оснований, атакже свободный G.
С помощью электрофореза вполиакриламидном геле каждую из четырех смесейразделяют на фрагменты разной длины. Затем гельпомещают на фотопленку, на которой появляетсяпочернение в тех местах, где находился радиоактивный материал (этот процесс называетсярадиоавтографией). Последовательность основанийпрямо считывается с пленки, как это показано, например, на рис. 19.3.Метод обрыва цепи использует другой подход.
Оносновывается на синтезе радиоактивно меченнойкомплементарной цепи ДНК с использованием в качестве матрицы нативной ДНК (гл. 20, 21). Синтезосуществляется с помощью фермента ДНК-полимеразы I (гл. 20, 21). В реакционной смеси присутствуютчетыре немеченных дезоксирибонуклеозидтрифосфата, из которых строится комплементарная цепь ДНК.Однако помимо них в системе находится модифицированная форма одного из оснований (его 2'3'-дидезоксианалог), при включении которой рост цепипрекращается. В результате синтезируются цепочкиДНК всевозможной длины. Используются четыре реакционные смеси, в каждую из которых добавляютпомимо четырех мономеров аналог одного из оснований в качестве терминатора роста цепи.
Затем цепи вкаждой смеси разделяют с помощью гель-электрофореза и проводят радиоавтографию. С полученной фотопленки непосредственно считывают последовательность оснований. Метод Сэнгера и др. был развит наоснове более раннего, так называемого плюс-минусметода, в котором также использовался синтез комплементарных цепей ДНК.19. Структура РНКРис. 19.1.Рибонуклеиновые кислоты (РНК) , присутствующие в клетках как про-, так и эукариот, бываюттрех основных типов: информационная (матричная,мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК).В ядре клеток эукариот содержится РНК четвертоготипа — гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). Унекоторых вирусов РНК служит носителемгенетической информации (гл.
5). мРНК являетсякопией (транскриптом) соответствующей ДНК. Этоттранскрипт служит матрицей для синтеза белка.Каждые три последовательных основания мРНК(называемые кодоном) детерминируют одинаминокислотный остаток. Молекулы тРНКпереносят специфические аминокислотные остатки копределенному участку мРНК в ходе синтеза белка. Внастоящее время структура тРНК хорошо из-вестна (см. ниже).
Молекулы рРНК встречаются в различных формах и образуют в комплексе с белками рибосому (гл. 24) — сложную органеллу, в которой происходит синтез белка.Сведберг (S)-единица измерения коэффициентаседиментации, являющегося мерой массы макромолекулы (гл. 44). Его находят, измеряя скорость осаждения молекул в центробежном поле. Значения коэффициента седиментации РНК Е.
coll приведены втабл. 19.1.Транспортная РНК (тРНК) узнает соответствующийкодон в мРНК и переносит нужную аминокислоту крастущей полипептидной цепи. Узнавание кодона вмРНК осуществляется с помощью трех последовательных оснований в тРНК, называемых антикодо-Таблица 19.1. Характеристики разных РНК Е. collТип РНКСодержание, %Коэффициент седиментации, SрРНК802365тРНКмРНК15544-26Мол. масса, Мг1 000 000500 00035 00025 00025 000-1000 000Число нуклеотидов300015001007575-3000ном.Аминокислотныйостатокможетприсоединяться к З'-концу молекулы тРНК.Специфичностьтакойсистемыпереносаобеспечивается тем, что имеется по крайнеймере одна тРНК для каждой аминокислоты.
Так,тРНК для Phe обозначается тРНКРЬе.Химическая структура тРНК. Молекула тРНК состоит примерно из 75 нуклеотидов, ковалентносвязанных друг с другом в линейную цепочку смол. массой Мг = 25000 и коэффициентомседиментации 4S. Установлены нуклеотидныепоследовательности многих тРНК; первая из них —для тPHKAla из дрожжей — была определена Холл ив1965г.ВсетРНКначинаютсясфосфорилированного 5'-конца; первым основанием обычно является G. На З'-конце всегдаприсутствуют три основания — ССА и концевая З'гидроксильная (—ОН) группа. СоставляющимитРНК являются не только четыре обычныхоснования А, С, G и U, но также нескольконеобычных,илиминорных,оснований.Например, в дрожжевой тРНКРhе минорными основаниямиявляютсяпсевдоуридин(обозначаемый Ψ), дигидроуридин (D) иоснование, обозначаемое Y.
Кроме того, внекоторых обычных основаниях один или дваатома водорода могут быть замещены на метильные (СН 3) группы; метилированные илидимети-лированныеоснованияотмечаютсясоответственно с помощью символов m или т 2при букве, обозначающей то или иноеоснование.Клеверный лист — это структурное представлениемолекулы тРНК, полученное из условия образования максимального числа уотсон-криковскихпар оснований при данной нуклеотиднойпоследовательности. Участки, в которых спомощью водородных связей образовалисьтакие пары оснований, называются стеблями, аодноцепочечные участки — петлями. Всеизвестные тРНК образуют «клеверный лист» счетырьмястеблями(акцепторным,D,антикодоновым и Т) и тремя петлями (D,антикодоновой и Т).
Некоторые тРНК имеютдополнительныепетлии/илистебли(например, вариабельная петля дрожжевойтPHKPhe).Трехмерная структура дрожжевой тPHKPhe была установлена с помощью рентгеноструктурногоанализа кристаллов этой тРНК. Термин«вторичнаяструктура»относитсякрасположению в пространстве атомов внутристебля. Третичная структура - это пространственное расположение всех частей молекулы.Вторичная структура Каждый стебель состоит из двухантипараллельных цепей, основания которых образуют друг с другом уотсон-криковские пары спомощьюводородныхсвязей.Такоепространственное расположение, установленноеэкспериментально, было правильно предсказаноисходя из структуры клеверного листа. Стеблиимеют форму правой двойной спирали,известной как А-форма РНК.Двойная спираль РНК в А-форме содержит 11пар оснований на виток, шаг спирали равен 3,1нм.
Расстояние между соседними парамиоснований вдольоси спирали составляет 0,28 нм (3,1 нм/11); ониповернуты друг относительно друга на угол 33°(360°/11). Плоскости оснований составляют ~20°с нормалью к оси двойной спирали. А-формаРНК близка к А-фор-ме ДНК (гл. 18). РНК неспособнапереходитьвВ-форму.Этообусловлено присутствием в ней объемной 2'гидроксильной группы рибозы, которой нет вдезоксирибозе.Третичная структура тРНК. Молекуланапоминает по форме букву Г.
Она значительноболее вытянута, чем глобулярные белки той жемолекулярной массы. Акцепторный и Т-стеблиуложены в пространстве таким образом, чтообразуют одну непрерывную спираль —«перекладину» буквы Г; антикодоновый и Dстебли образуют «ножку». Эти две части содержаткаждая около 10 пар оснований. Почти всеоснованиявтРНКучаствуютввандерваальсовыхигидрофобныхвзаимодействиях,стабилизирующихпространственную структуру молекулы.В тРНК имеются разнообразные водородныесвязи. В стеблях, являющихся двойнымиспиралями,образуютсяуотсон-криковскиеводородныесвязи.Многиеоснования,расположенные вне стеблей, образуют водородные связи с другими основаниями, но этисвязиотличаютсяотуотсон-криковских.Помимоэтого2'-гидроксильныегруппыполинуклеотиднойцепитакжеобразуютводородные связи — с основаниями и с атомамиводорода основной цепи.Антикодон молекулы тРНК - это три последовательных основания, с помощью которыхраспознается соответствующий кодон мРНК.Узнавание осуществляется путем образованияуотсон-криковских водородных связей междуоснованиями кодона, с одной стороны, иантикодона — с другой, при условии чтополинуклеотидные цепи антипараллельны (рис.19.2).ДРУГИЕ МОЛЕКУЛЫ РНК.
К такиммолекулам относятся мРНК и одноцепочечнаявируснаяРНК.Ихнуклеотиднаяпоследовательность также была определенаэкспериментально. Эти исследования показали,что отдельные участки молекул РНК могут,подобнотРНК,образовыватьшпильки,стабилизированные водородными связями.Двухцепочечная вирусная РНК, по-видимому,находится в А-подобной форме. Для болееподробного изучения строения всех этихмолекулнеобходимырентгеноструктурныеисследования.СЕКВЕНИРОВАНИЕ РНК в настоящее времяможет осуществляться очень быстро, причемсразу для участков длиной в несколько сотеноснований.
Раньшеэта процедура была весьма длительной и трудоемкой иможно было определять последовательность участковРНК длиной не более 100 оснований (как в работеХолли 1965 г.; см. выше). Ныне для этой цели используется ряд методов. Здесь применяют два основныхподхода — прямой подход и метод копирования.В случае прямого подхода определяют последовательность оснований в самой РНК. Сначала метят 5'или З'-конец молекулы РНК с помощью 32РО4. Затеммеченую цепь расщепляют с помощью ферментов, специфичных к определенным последовательностям. Проводя гель-электрофорез и радиоавтографию, получаюткарту, по которой находят последовательность оснований, подобно тому как это делается для ДНК (гл.
18).В методе копирования вначале синтезируют цепочку ДНК,комплементарную РНК, и затем с помощью методов,описанных в гл. 18, определяют ее нуклеотид-нуюпоследовательность. Для получения комплементарнойцепи ДНК обычно используют обратную транскриптазу. Это фермент обнаружен в некоторых вирусахи осуществляет обратную транскрипцию, т. е. катализирует процесс синтеза ДНК (обозначаемой кДНК),комплементарной РНК-матрице. (Обратная транскрипция — это процесс, играющий ключевую роль ипри клонировании генов; см. гл. 30.) Пусть, например,какой-то участок РНК имеет последовательность 3'GGGUCA. Тогда кДНК будет иметь последовательность 5'-GCCAGT. Применив метод химического расщепления для секвенирования ДНК (гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
