Э. Рис, М. Стернберг - Введение в молекулярную биологию от клеток к атомам (1160049), страница 17
Текст из файла (страница 17)
18), получаютрадиоавтограмму, представленную на рис. 19.3.20. Основы репликацииРепликация ДНК — это процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК. Мы рассмотрим здесь репликацию только двухцепочечной ДНК;репликация одноцепочечной вирусной ДНК описанав гл.
4.При полуконсервативной репликации дочерниеклетки первого поколения получают одну цепь ДНКот родителей, а вторая цепь является вновь синтезированной. Такой же процесс повторяется при образовании дочерних клеток второго поколения из клетокпервого поколения. Таким образом, только две из четырех дочерних клеток второго поколения содержатпо одной цепи исходной родительской ДНК, образующей двойную спираль с новосинтезированной цепью. Остальные две дочерние клетки второго поколения не содержат исходной родительской ДНК.
Процесс полуконсервативной репликации на протяжениидвух поколений иллюстрирует рис. 20.1.Мезельсон и Сталь в 1958 г. доказали, что репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму. Сначала они выращивали бактерии длительноевремя на среде, содержавшей тяжелый изотоп азота( I5N), который включался в ДНК, а затем переносилиих на среду, содержащую обычный (легкий) изотопазота (14N). После репликации дочернюю ДНК первогопоколения фракционировали по плотности. Оказалось, что вся дочерняя ДНК однородна и имеет плотность, промежуточную между плотностью тяжелой илегкой ДНК.
Следовательно, одна цепь молекулы дочерней ДНК содержала I5N, а другая 14N, что отвечаетполуконсервативному механизму репликации.Спаривание оснований в родительской ДНК означает, чтопротив G в одной цепи всегда располагается С, апротив А - всегда Т. При репликации цепи родительской ДНК расплетаются, и каждая из них служитматрицей, определяющей последовательность оснований в новой, комплементарной цепи ДНК. Такимобразом, информация, заключенная в последователь-Рис. 20.2.ности оснований ДНК, с высокой точностью передается следующему поколению.Инициация синтеза в небольших геномах эукариот(вирусов) и прокариот (например, Е.
coli) происходитв одной строго определенной точке. Репликация ДНКу прокариот осуществляется довольно быстро: у Е. coliее скорость составляет 1700 пар оснований в 1 с, такчто весь геном копируется за 40 мин. В более крупныхклетках, например в клетках животных, репликацияпроисходит медленнее — скорость ее составляет примерно 50 пар оснований в 1 с. Однако инициация вэтом случае осуществляется сразу в нескольких местахмолекулы ДНК, т. е. в ДНК эукариот образуется много единиц репликации, называемых репликонами. Врезультате хромосома дрозофилы, например, состоящая из 65 • 106 пар оснований, реплицируется за несколько минут.
Для инициации репликации двухцепочечная ДНК должна расплестись в точке начала репликации и образовать петлю (рис. 20.2).Репликативная вилка - это та часть молекулы ДНК,которая уже расплелась и в данной момент служитматрицей для синтеза дочерней ДНК. В ходе репликации репликативная вилка перемещается вдольмолекулы.Двунаправленная репликация— это наиболее распространенный механизм репликации ДНК. Послеинициации репликация идет одновременно в обоихнаправлениях вдоль цепи ДНК.
Для осуществлениясинтеза двойная спираль родительской ДНК должнараскрутиться и ее цепи должны разойтись. В этих процессах участвуют различные белки (гл. 21). В линейной ДНК раскручивание осуществляется путем вращения одной цепи вокруг другой. В двухцепочечнойкольцевой ДНК, например в ДНК Е.
coli, раскручивание и репликация ведут к образованию структуры, напоминающей кольцо с внутренней петлей. Ее называют тэта-петлей, поскольку по форме она похожа нагреческую букву Θ.Кэрнс первым наблюдал такие петли с помощьюрадиоавтографии. Культуру Е. coli выращивали насреде, содержавшей радиоактивные нуклеотиды, которые включались в ДНК. Затем реплицирующуюсяДНК наносили на фотопленку, на которой и получалось изображение Θ-петли.Однонаправленная репликация — более редкое явление; она наблюдается у некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК, например у вирусафХ174. Однонаправленная репликация происходитпосле образования двухцепочечной формы ДНК вклетке-хозяине. Механизм, с помощью которого этоосуществляется, называется механизмом катящегосякольца. В одной из цепей ДНК (наружной на рис.
20.2)образуется разрыв, и синтез новой цепи начинается сЗ'-конца этой разорванной родительской цепи с использованием второй (внутренней) в качестве матрицы. Это приводит к вытеснению 5'-конца наружнойцепи, которая впоследствии служит матрицей длясинтеза другой новой цепи.21. Репликация у прокариотE.coli - это бактерия, содержащая двухцепочечнуюкольцевую ДНК.
Репликация ДНК Е. coli изученавесьма детально, и нам известны механизмы многихстадий этого процесса. Эти механизмы характерныдля репликации всех прокариот. Аналогичным образом протекает репликация у эукариот, но в ней участвуют другие ферменты.ДНК-полимеразы — это ферменты, участвующие всинтезе ДНК. Ферменты присоединяют нуклеотид к—ОН-группе на З'-конце одной из цепей ДНК, которая, следовательно, растет в направлении 5' —> 3'. Поэтому говорят, что данные ферменты обладают 5' —>З'-полимеразной активностью. Для синтеза новой цепи ДНК необходимы: 1) ДНК-матрица, которая может быть как в одно-, так и в двухцепочечной форме;2) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ATP, CTP,GTP и ТТР) и 3) З'-ОН-группа нуклеиновой кислотызатравки, к которой присоединяется следующее основание.
Схема реакции показана на рис. 21.2.Выделены три ДНК-полимеразы — I, II и III, обозначаемые polI, polII и polIII. Хотя первой была выделена polI (Корнбергом в 1958 г.), основным ферментом , катализирующим синтез растущей цепи ДНК,является polIII. PolI участвует в процессе созревания(см.
ниже), роль роШ неясна. Помимо 5' —> З'-полимеразной активности все три фермента проявляютспособность деградировать ДНК, отщепляя нуклеотиды в направлении У —> 5', т. е. являются У —> 5'-экзонуклеазами. Poll и pollII обладают также 5' —> З'-экзонуклеазной активностью.Репликативная вилка – это та часть молекулыДНК, в которой в данный момент осуществляетсясинтез новой ДНК. Здесь родительская ДНК расплетена и находится в одноцепочечной форме. Каждая изцепей служит матрицей для синтеза новой ДНК.
В ходе синтеза репликативная вилка перемещается вдольмолекулы, и при этом расплетаются все новые участки родительской ДНК — до тех пор, пока вилка недойдет до точки окончания синтеза (точка терминации). Поскольку ДНК-полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5' —» 3', а цепи родительской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно; она называетсялидирующей. Вторая цепь, называемая отстающей,синтезируется в виде фрагментов, которые затем сшиваются (лигируются), и образуется непрерывная вторая цепь. Этот процесс называется созреванием.Фрагменты ДНК, о которых идет речь, называютсяфрагментами Оказаки, по имени исследователя, который их впервые обнаружил.
У прокариот они имеютдлину около 1000 нуклеотидов, а у эукариот — 100—200нуклеотидов.Для синтеза ДНК необходима РНК - затравка. Поскольку для своей работы ДНК-полимераза нуждаетсяв свободной З'-ОН-группе, возникает вопрос, как начинается синтез ДНК. В результате многочисленныхисследований было показано, что синтез начинаетсяна маленьком фрагменте РНК, выступающей в ролизатравки (праймера). Сначала фермент РНК-полимераза, не нуждающийся для инициации синтеза в свободной З'-ОН-группе, синтезирует короткую молекулу РНК (длиной 10—60 нуклеотидов), используя в качестве матрицы родительскую двухцепочечную ДНК.Эта РНК-затравка остается спаренной с расплетеннойДНК и действует как место инициации синтеза, предоставляя свою свободную З'-ОН-группу для присоединения первого нуклеотида ДНК; эту последнююоперацию производит ДНК-полимераза III.
Аналогичная затравка образуется и перед синтезом отстающей цепи, но, поскольку матрицей для ее образованияслужит одноцепочечная ДНК, бактерии часто используют для синтеза РНК-затравки другой фермент праймазу. РНК-матрица удаляется из молекулы ДНКв процессе созревания с помощью poll.При созревании РНК-затравка удаляется как с 5'конца лидирующей цепи, так и с 5'-концов фрагмен-тов Оказаки, а эти фрагменты сшиваются друг с другом. Удаление РНК-затравки осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I, действующей как У —> 5'-экзонуклеаза.
Этот же фермент присоединяет вместоудаленной РНК дезоксинуклеотиды, используя приэтом свою 5' —> З'-полимеразную активность. Наконец, фермент ДНК-лигаза соединяет в нужном порядке фрагменты ДНК, катализируя образование фосфодиэфирной связи.«Корректорская правка» — это удаление неправильных(образующих некомплементарные пары) оснований,включенных во вновь синтезированную ДНК. Этотпроцесс обеспечивает чрезвычайно высокую точностьрепликации, отвечающую одной ошибке на 109 пароснований.
Коррекция осуществляется в тех случаях,когда к З'-концу растущей цепи присоединяется«неправильный»нуклеотид,неспособныйобразовывать нужные водородные связи с матрицей.Когда polIII ошибочно присоединяет неправильноеоснование, «включается» ее 3'—5'-экзонуклеазнаяактивность, и это основание немедленно удаляется,после чего восстанавливается полимеразная активность. Такой простой механизм действует благодарятому, что pollII способна работать как полимеразалишь на совершенной двойной спирали ДНК с абсолютно правильным спариванием оснований.Расплетание двойной спирали РНК необходимо длятого, чтобы цепи ДНК могли разойтись и играть рольматриц при репликации.
У Е. сой имеется особый фермент, так называемый rep-белок, который выполняетфункцию расплетания двойной спирали. Энергия, необходимая для этого, получается за счет гидролизаАТР. Образовавшиеся при расплетании одноцепочечные участки ДНК стабилизируются в этом состояниицелым рядом белков: это белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК, белок, дестабилизирующийдвойную спираль, ДНК-связывающий белок и белок,расплетающий двойную спираль.Топоизомеразы—ферменты,катализирующие переходы в молекулах ДНК,связанные с изменением степени сверхспирализации.ДНК,различающиесятолькопостепенисверхспирализации, называются топологическимиизомерами или топоизомерами, отсюда и названиеферментов — топоизомеразы. Одни топоизомеразывызывают релаксацию сверхспиральной ДНК, адругие, напротив, приводят к появлению в нейсверхвитков (гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
