Диссертация (1154338), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Эксперименты на животных проводились в два этапа. На первом этаперазрабатывалсяспособмоделированиявнутрибрюшинныхспаек(гемоперитонеум) у крыс и кроликов. На втором этапе на разработанной моделигемоперитонеума проведено 3 серии экспериментов на крысах, обозначенных: I,II, III и IV серия экспериментов на кроликах. V серия исследований проведена вперевиваемой культуре дермальных фибробластов человека (Human DermalFibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience.VI серия экспериментовпроведена на крысах, которым моделировали скальпированную рану споследующим формированием патологического кожного рубца.В I серии экспериментов после моделирования у крыс гемоперитонеума,на 7, 10 сутки после введения аутокрови исследовали морфологическиехарактеристики пеританеальных спаек, биохимический состав и цитокиновыйпрофиль перитонеальной жидкости (2-я группа). Контролем служили 20сопоставимых по полу и возрасту здоровых крыс (3-я группа), получивших 0,9%раствор NaCl тем же способом и в том же объеме.Таблица2.РаспределениеэкспериментальныхживотныхпоразделамисследованияЭтапыСерия,ГруВидКоличествоисслед видппвоздействиживования животыяотны римеРаздел исследованийногоI этапх1крысаРазработкаспособамоделированиявнутрибрюшинных спаекэкспентов20аутокровь2070кролик 1Разработкаспособамоделирования10аутокровь10внутрибрюшинных спаекII этап2IIаутокровьвнутрибрюшинногоIкрысыМоделирование8686спайкообразования34крыса0,9%КонтрольПервичнаяр-рNaCl40культураактивированныхперитонеальных клеток без40160-*лекарственных средств5Первичнаякультураактивированныхперитонеальных клеток +160верапамил*верапамил6Первичнаякультураактивированныхперитонеальных клеток +160дилтиазем*дилтиазем7Первичнаякультураактивированныхперитонеальных клеток +160нифедипин*нифедипин8Первичнаякультуранеактивированныхперитонеальных клеток от80-^интактных крысIII9Кардио-и верапамил75, в71крысагемодинамическиет.ч.эффекты верапамила, в томчисле:9аВведениеверапамил0,1мг/кг,исследование через 15 мин;100верапамил252 ч.,4 ч.9бВведениеверапамил0,2мг/кг,исследование через 15 мин;100верапамил252 ч.,4 ч.9вВведениеверапамил0,4мг/кг,исследование через 15 мин;100верапамил252 ч.,4 ч.10Профилактикаспайкообразованияверапамилом 0,1 мг/кгIV1кроликаутокровь+верапамил4646Моделирование22внутрибрюшинногоаутокровь22спайкообразования2Профилактикаспайкообразованияверапамилом 0,1 мг/кг3V1верапамил0,9%КонтрольПерививаемаяаутокровь+NaClкультурадермалдермальных фибробластовьныеПерививаемаяTNF-αкультура TNF-α+р-р22221010404072фибродермальных фибробластовбластыПерививаемаячеловедермальных фибробластовкакультура TNF-α+Перививаемая40дилтиаземкультура TNF-α+дермальных фибробластов1верапамил40нифедипинМоделирование38патологическихкожныхрубцов и их профилактика верапамилверапамиломв38составаантирубцового кремаVI2Моделированиеводно-патологическихкрысарубцовосновыикожных вазелиннанесением ланолинова 38кремабез яверапамила3НанесениеВсего экспериментовВсего животных- крыс- кроликовКонтрольосновакремаантирубцовыйкрема на здоровую кожу438верапамил20-104472010154238364* - перитонеальные клетки получены от 36 крыс группы 2; ^ - от 20 крыс группы3Во II серии in vitro проведено тестирование лекарственных средств наклеточных культурах с подбором оптимальной дозы для выявления, неописанного ранее фармакологического действия у БМКК: верапамила, дилтиазем73и нифедипина в качестве регуляторов функции фибробластов при индукцииспаечных процессов.
II серию экспериментов составили 5 исследовательскихгрупп. В 4-й группе в культуре исследовали активированные фибробласты имакрофаги без добавления в ростовую среду лекарственных средств (контроль).В суспензии клеток 5-ой группы добавляли раствор верапамила, 6-й группы дилтиазема и 7-й группы - нифедипина в концентрациях 0.00005 мл-1 и 0.0001мл-1. 8-ю исследовательскую группу II серии экспериментов составили культурынеактивированных клеток, забранных у интактных крыс.Через 24 часакультивирования исследовали пролиферативную активность фибробластов иклеток их микроокруженияфибробластамимононуклеарных фагоцитов, темпы синтезакомпонентовмежклеточногоматрикса,уровеньпровоспалительных цитокинов TNF-, IL-1.ВIII серии экспериментов in vivo, после проведения культуральногомодуля и выявления среди исследованных БМКК препарата (верапамил),оказывающегонаиболее выраженный фармакологический эффект в культуре,провели оценку действия верапамила на формирование соединительной ткани вцелостном организме крыс после моделирования гемоперитонеума.
В 9-ой группекрыс (подгруппах III.9а, III.9б,верапамила,исходяизIII.9в) определяли режим дозированиянеобходимостиминимизироватькардио-игемодинамические эффекты препарата. Крысам 10-й группы для профилактикиэкспериментального спаечного процесса интраперитонеально одновременно саутокровью вводился верапамил в дозе 0,1 мг/ кг массы тела. Эффективностьизучаемого метода профилактики спайкообразования оценивалась через 7-10суток.В IV серии экспериментов in vivo для подтверждения универсальностиразработанной модели асептического перитонеального спайкообразования иидентичности действия верапамила на разные виды животныхпроведеныэкспериментальные исследования на кролика-самца породы Шиншилла.
В 1-ю74группу вошли животные с гемоперитонеумом, которые не подвергались какомулибо фармакологическому воздействию. 2-ю группу составили кролики, которымвнутрибрюшинно вводился верапамил в дозе 0,1 мг/ кг массы тела. Введениепрепарата производилось сразу после моделирования асептического воспалениябрюшины инъекцией аутокрови. Контролем (3-я группа) служили кроликианалогичного пола и массы тела, которым внутрибрюшинно был введен 0,9%раствор NaCl в количестве 1% массы тела. На 7-10 сутки после гемоперитонеумаи введения верапамила проведена оценка морфологических характеристикпеританеальныхспаек,биохимическогоицитологическогосоставаперитонеальной жидкости.V серии экспериментов проведена на перевиваемой культуре дермальныхфибробластов человека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства AxolBioscience).
В 1-ю группу вошли пулы культур клеток, которыеподвергалидействию TNF-a (30 нг/мл, производства «Sigma», Великобритания) длястимуляцииактивностиядерногофакторатранскрипцииNF-kBикультивировали без добавления лекарственных средств. В аналогичные культурыклеток2-й группы добавляли раствор верапамила,3-й группы - раствордилтиазема, 4-й группы – раствор нифедипина.В VI серии экспериментов на крысах, после моделирования патологическихрубцов кожи, исследовали действие разработанного нами антирубцового крема сверапамилом (патент 2290919 РФ). Животные со сформированными рубцамибыли разделены на 3 группы. В 1-й группе крыс проводили лечение сприменением верапамилсодержащего крема.
Крысам 2-й группына рубецнаносили водно-вазелин-ланолиновую основу крема без верапамила. 3-й группекрыс антирубцовый крем наносился на здоровый участок кожи в центре спины.Контрольную группу составили 10 интактных крыс. Крем или его основунаносили ежедневно дважды, втирая их в зону рубца.
По окончанииэкспериментов, через 10, 30 и 60 суток с момента формирования рубца, животныхвыводили из опыта.752.2. Экспериментальное обоснование доз БМККпри спайкообразовании in vivo и in vitro2.2.1 Подбор дозового режима интроперитонеальноговведения верапамила крысамУчитывая, что традиционной областью применения БМКК являетсякардиология, а наличие выраженного кардио- либо ангиотропного действияверапамила минимизировало бы значимость предполагаемого его влияния наформирование соединительной ткани и делало бы проблематичным клиническоеиспользование верапамила для предотвращения избыточного спайкообразования,нами в остром эксперименте на крысах (серия III группа 9, подгруппы 9а, 9б, 9в)изучено влияние убывающих доз верапамила на системную гемодинамику ифункции миокарда (уровни систолического, диастолического и среднегоартериального давления, периферическое сосудистое сопротивление и показателисердечного выброса) в течение 4 часов после внутрибрюшинной инъекциипрепарата.
Использовали водный раствор верапамила 0,25% концентрации вампулах по 2 мл производства ОАО ―Биосинтез‖, г. Пенза, Россия.Всоответствии с ОСТ 42-511-99 «Правила проведения качественных клиническихиспытаний в Российской Федерации» от 29.12.98 года нами был выбранследующий диапазон исследуемых доз: 0,4 мг/кг массы тела животного (III. 9агруппа), 0,2 мг/кг (III.9б группа), 0,1 мг/кг (III.9вгруппа). Регистрацияпараметров гемодинамики и функций миокарда проводилась исходно, довведения верапамила и через 15 минут, 2 часа и 4 часа после инъекции. Изучалидозозависимое влияния верапамила на уровни систолического, диастолического исреднего артериального давления, периферическое сосудистое сопротивление ипоказатели сердечного выброса. За оптимальную дозу, используемую вдальнейшем для внутрибрюшинного введения в основной серии экспериментов(для профилактики спайкообразования), принималась максимальная переносимая76доза (0,1 мг/кг массы тела животного), не вызывавшая значимых и достоверныхизменений кардио- и гемодинамики.2.2.2.
Выявление дозозависимого действие БМККна фибробласты и макрофаги в культуре клетокПроведено тестирование лекарственных средств на клеточных культурах:первичной культуре перитонеальных фибробластов и макрофагов крыс иперевиваемойкультуредермальныхфибробластов человекасподборомоптимальной дозы для выявления, не описанного ранее фармакологическогодействия у известных, зарекомендовавших себя в кардиологической практикеБМКК: производных фенилалкиламина (верапамил), бензотиазепина (дилтиазем),дигидропиридина (нифедипин)на функции перитонеальных фибробластов имакрофагов. Использовали: раствор верапамила 0,25% концентрации в ампулахпо 2 мл производства ОАО ―Биосинтез‖, г.
Пенза, Россия; раствор дилтиазема(Diltiazem Hydrochloride Injection) производства компании Hospira во флаконах по10 мл в концентрации 5 мг/мл;раствор нифедипина (Адалат производствакомпании Bayer, Германия, во флаконах по 50 мл в концентрации 100 мкг/мл).Исследования каждого лекарственного средствав культуре клетокпроводили с использованием 2 концентраций (0,00005 мл -1 и 0,0001 мл-1) последующей схеме: культуру активированных перитонеальных фибробластов имакрофагов высевали в чашки Петри со стеклами, покрытыми поли-D-лизиномдля адгезии клеток, и одновременно добавляли в первую чашку Петри верапамилв концентрации 0,00005 мл-1, во вторую - верапамил 0,0001 мл-1, в третью дилтиазем0,00005 мл-1, в четвертую - дилтиазем0,0001 мл-1, в пятую -нифедипин – 0,00005 мл-1, в шестую - нифедипин – 0,0001 мл-1. Исследованиякаждой дозы препаратов проводили в дублях.
Контролем служила культураактивированных фибробластов и макрофагов без добавления в ростовую средуфармакологических препаратов. После внесения в чашки Петри суспензии клетоки добавления БМКК в ростовую среду их помещали в С02-инкубатор на 24 часа77(37оС, 5% СО2).По окончании культивирования клетки подвергалицитологическому анализу с оценкой пролиферативной активности моноцитов ифибробластов,всупернатантахгиалуроновой кислоты,определяликоличествооксипролина,провоспалительных цитокинов: TNF- и IL-1.Тестирование лекарственных средств (верапамил, дилтиазем, нифедипин) наперевиваемойкультуредермальныхфибробластовчеловекапроведеноаналогичным способом с использованием того же дозового режима и основныхэтапов постановки.2.3. Методы исследования2.3.1. Культуральные методыБольшинствоисследованийпроведенонаперитонеальных фибробластов и макрофагов крыс,первичнойкультуреисследования ядерноготранскрипционного фактора NF- kB (p50/p65) выполнены так же и наперевиваемой культуре дермальных фибробластах человека (Human DermalFibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience).Работу с клеточнымикультурами производили с соблюдением правил асептики и антисептики встерильномбоксе,оборудованномламинарнымшкафом2-гоклассабиологической безопасности (Labconco, США) и СО2 — инкубатором длякультивирования клеток (Revco, США).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
