Диссертация (1152197), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Затем из комплекса Е-Suc высвобождается глюкоза (Glu), с образованиемвторого комплекса E-Fru. Этот комплекс взаимодействует со стевиозидом, что приводит кобразованию третьего комплекса E-FSte и затем высвобождения FSte. В этой системе наряду среакцией трансфруктозилирования, протекает гидролиз сахарозы и фруктозил-стевиозида.Синтез фруктозил-стевиозида подавляется глюкозой и фруктозой. Концептуальная схема общегомеханизма реакции показана на рисунок 33.E-GluGluGluE-FRuSucEFruE-SucSucFruH2OFSteE-FruSteFSteFruGluE-FSteSteРисунок 33 - Концептуальная схема общего механизма реакции синтеза фруктозилстевиозида (Suzuki et al., 2002)73В наших экспериментах с целью трансфруктозилирования РебА, β-фруктофуранозидазуполучали из Arthrobacter sp.
K-1 (FERM BP-3192) (Япония), Arthrobacter sp. CICC 10137(Коллекция промышленных культур, Китай), Microbacterium saccharophilum NBRC 108778(Япония), Aspergillus niger IMI 303386 (Великобритания), Schwanniomyces occidentalis ATCC26077 (США), Aureobasidium pullulans DSM 2404 (ФРГ).Для этого раствор РебA (0,05 M; 0,48 г), сахарозы (2,0 M; 6,85 г) и b-фруктофуранозидазы(50 единиц на 1 г сахарозы) в 20 мл воды (pH 6,5-7,0) инкубировали при 40oC в течение 20 ч припостоянном перемешивании.Фермент инактивировали при 100oC в течении 10 мин, иреакционную смесь очищали на адсорбционной смоле Diaion HP-20, используя воду дляпромывкииэтанолдляэлюирования,аналогичновышеописанномувслучаесглюкозилированными производными.Наилучшие результаты по выходу фруктозилированного РебА получены со штаммомArthrobactеr sp. К-1, фермент которого гидролизовал моно-β-2,6-фуранозилированный вположении 19-O-глюкозильного остатка производную РебА (RebА-F) с достаточно высокимвыходом, т.е.
данная β-фруктофуранозидаза строго специфична к позиции С-19 (рисунок 34).Поэтому, все дальнейшие эксперименты проводили с применением данного фермента.Рисунок 34 - Трансфруктозилирование РебAВыход продукта реакции трансфруктозилирования зависит в значительной степени отконцентрации и соотношения акцептора, донора и фермента, а также от времени.Трансфруктозилирование проходит более эффективно при избытке сахарозы.
Выход монофруктозилированного производного составляет 70%, при условии количества компонентовреакции 0,5% РебA, 5% сахарозы и времени протекания реакции 17 часов.Дальнейшаяочисткаперекристаллизации из метанола.полученногокомпонентаосуществляетсяметодом744.1.Культивирование Arthrobacter sp. K-1Для получения β - фруктофуранозидазы использовали культуру Arthrobacter sp. K-1.Культуру Arthrobacter sp. K-1 поддерживали на питательном агаре "Nissui", содержащий0,5% дрожжевого экстракта, 1,0 % полипептона и 0,5% NaCl (pH 7,0).Культивирование в глубинных условиях в колбах для получения инокулянта реализовалипри 30°C в течении 48 ч на жидкой питательной среде, содержащей 1,2% дрожжевого экстракта,0,8% полипептона, 4,0% лактозы, 0,4% (NH4)2HPO4 и 0,1% MgSO4х7H2O (pH 7,0).Культуральная жидкость в количестве 420 см3 переносили в 10 дм3 ферментёр спитательной средой.- 5,0% кукурузный экстракт,- 3,0% сахароза,- 0,4% (NH4)2HPO4,- 0,1% MgSO4х7H2O (pH 7,0)Культивирование осуществляли при 37°C в течении 24 ч, в условиях постоянной аэрации иконтроля pH в пределах 6,8-7,2 с помощью 2Н NaOH.Культуральную жидкость центрифугировали при 12,000 оборотах (20 мин, 4°C),отфильтровывали через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,45мм и сконцентрировали наультрафильтрах.
Концентрат внеклеточного фермента хранили при 4°C.β-Фруктофуранозидазную (ФФаза) активность определяли в КЖ и УФ по количествувосстанавливающих сахаров, освободившихся в результате гидролиза сахарозы.4.2. Влияние концентрации раствора и соотношение РебА и сахарозы навыход фруктозил-РебА (Fru-РебА)Раствор сахарозы в воде и фермент ФФаза инкубировали в присутствии различныхконцентраций РебA при 40оC. Количество фруктозил-РебA в реакционной смеси определялось спомощью ВЭЖХ. Результаты объединены в таблице 13.Таблица 13 - Влияние концентрации акцептора и времени реакции на формирование Fru-РебА(общая концентрация сухих веществ - 35%; 40оС; pH 6,5)Соотношение (вес/вес)РебАСахароза1213Время реакции,час244872244872Трансфруктозилирование, %фруктозил-РебА5,420,132,06,924,636,57514151617Таблица 13 - продолжение9,329,238,523,332,741,224,735,444,333,638,748,8244872244872244872244872Выход трансфруктозилирования существенно зависит от концентрации акцептора, донораи фермента, а также от времени реакции.
Получение фруктозил-РебA более эффективно приизбыточных количествах сахарозы. Так, если при массовом соотношении РебА к сахарозе 1:1степень трансфруктозилирования за 24 ч была всего 5,4%, то при соотношении 1:5, достигает добольше,чем23%.Степеньтрансфруктозилированиясущественноувеличиваетсяспродолжительностью реакции, как это показано для 24 ч, 48 ч и 72 ч (таблица 13 и рисунок 35).Степеньтрансфруктозилирования,%6024ч48ч72ч50403020100СоотношениеРебАкСахарозеРисунок 35 - Влияние соотношения сахарозы и РебА, а также времени на степеньтрансфруктозилирования76Выявлено,чтотрансфруктозилированиепротекаетболееэффективновконцентрированных растворах.
Чем выше общая концентрация сахарозы и РебА, тем большеТрансфруктозилирование,%отмакс.выход фруктозилированного РебА (рисунок 36).100908070605040302010051015202530404550Обшаяконцентрацияреакционнойсмеси,%Рисунок 36 – Влияние концентрации реакционной смеси на степень трансфруктозилирования(соотношение сахарозы к РебА = 10 : 1 в/в, 48 ч; 40C0)4.3. Влияние рH, температуры и количества ферментаС целью определения влияния рH на трансфруктозилирование, β-фруктофуранозидазуинкубировали с раствором 1%-ного РебА и 10%-ной сахарозы при 40оC в течении 15 ч приразличных рН.
Выявлено, что реакция трансфруктозилирования наиболее эффективно протекаетТрансфруктозилирование, %от макс.в интервале рН 6,5-8,0 (рисунок 37).10090807060504030201004.555.566.577.588.5pHРисунок 37 - Влияние рH на трансфруктозилирование РебА с помощью β-фруктофуранозидазыиз Arthrobacter sp. K-177Для выявления наилучшей температуры, фермент инкубировали при различныхтемпературах с раствором 1%-ного РебA и 10%-ной сахарозы при рH 6,7 в течение 15 часов припостоянном перемешивании. Реакция имеет четко выраженный температурный оптимум при40оС. Отклонение от этого приводит к резкому падению эффективности реакции (рисунок 38).Трансфруктозилирование, % от макс.10080604020030354045505560Температура, оСРисунок 38 - Влияние температуры на трансфруктозилирование РебА с помощью βфруктофуранозидазы из Arthrobacter sp.
K-1Выявлено также, что с увеличением количества фермента происходит ускорение реакции.Наиболее оптимальным оказались количества 50-100 единиц на 1 г сахарозы (рисунок 39).Трансфруктозилирование, % от макс.100806040200102030405060708090100110Количество фермента, ед/г сахарозыРисунок 39 - Влияние количества β-фруктофуранозидазы на трансфруктозилирование РебА784.4. Выделение и очистка фруктозилированного РебAРаствор 49 г РебА и 340 г сахарозы растворяли в 1 дм3 деионизированной воды, добавляли80 ед/г сахарозы β-фруктофуранозидазы и реакцию осуществляли при 40оС в течение 48 ч припостоянном перемешивании.Реакцию останавливали кипячением, охлаждали, добавляли ровный объем абсолютногоэтанола и осадок отделяли фильтрованием.
Фильтрат обрабатывали активированным углем (1%)при 50-60оС в течение 20 мин для обесцвечивания. Этанол выпаривали и остаток очищали надвух колонках с макропористой смолой Diaion HP-20. Колонки последовательно промывали 10ю объемами воды и 10%-ным этанолом, и адсорбированные гликозиды элюировали 5-юобъемами 70%-ного метанола.
Метанол удаляли вакуум-выпариванием и содержание гликозидовпроверяли методом ВЭЖХ на колонке Zorbax-NH2 (4мм x 250 мм) при температуре колонки 40оСс использованием смеси ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 (объем/объем) в качествеподвижной фазы, скорости потока 1 мл/мин и DAD детектора, УФ (210 нм). Элюат из первойколонки представляет собой смесь основного количества не модифицированного РебА, в товремя как второй содержит более чем 80% фруктозил-РебА (рисунок 40).Рисунок 40 - ВЭЖХ-граммы элюатов из первой (А) и второй колонок (B)79Дальнейшуюочисткуфрукозил-РебАосуществляликристаллизациейиперекристаллизацией из минимального количества абсолютного метанола, в котором онпрактически нерастворим.
Немодифицированный РебА остается в фильтрате, а чистота белыхкристаллов фруктозил-РебА достигает до 95% и более (рисунок 41).Рисунок 41 - ВЭЖХ-грамма фруктозил-РебА после перекристаллизации из абсолютногометанолаДля точной идентификации продуктов использовали масс-спектрометрический (MС)анализ в системе Agilent 6110 Series Quadrupole LC/MS с колонкой силикагель С18.Фруктозил-РебА, C44H70O23, b-2,6-фруктозилированный у 19-O-глюкозильной группы, иидентифицирован как b-D-фруктофуранозил-2,6-b-D-глюкопиранозильный эфир стевиол-13-Ob-D-глюкопиранозил-1,2-b-D-глюкопиранозил-1,3-b-D-глюгопиранозидамассой 1128 (рисунок 42).смолекулярной80Рисунок 42 - MSD анализ РебА (А) и фруктозил-РебА (B)81Улучшено качество вкусового профиля, послевкусия, горечи и приятности вкуса дляфруктозилированного РебA (Чхан, Мойсеяк, 2019б).
Полученные вкусовые характеристикисопоставимы с вкусовыми характеристиками аспартама и гораздо лучше, чем у РебА.Наблюдалось некоторое уменьшение горечи и улучшение вкусового профиля относительноРебА, однако послевкусие производного было несколько сильнее, чем у РебА. Интересно, чтовкусовые характеристики фруктозилированного стевиозида сопоставимы с таковыми аспартамаи превосходят РебА. Однако, фруктофуранозная связь не стабильна и может гидролизоваться вусловиях приготовления пищи.ГЛАВА 5.
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ВКУСОВЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ ИСТРУКТУРОЙ ГЛИКОЗИДОВ СТЕВИИКачество и интенсивность сладости гликозидов стевии зависит от их строения и, вособенности, типа и количества углеводных единиц в их структуре, а также характера иконфигурации связей (Patent US WO 2017/106577, 2017). Известные в настоящее времягликозиды приведены в таблице 14.Таблица 14 - Строение и некоторые характеристики природных гликозидов стевииСоединение19-Oгликозил(R2)13-O-гликозил(R1)Растворимостьвводе%СладоськсахаруКачествовкуса0,02НО0,030,03НОНО90150ГорькийГорькийГорькийГорький0,5830ГорькийГлюкозные остатки отсутствуют на C-19СтевиолСтевиолмонозидСтевиолбиозидРебBHHHHHb-Glub-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (3,1)Дулкозид BHb-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu (3,1)Один глюкозный остаток на C-19Стевиол-19-OглюкозидРубузозидСтевиозидb-GluHНИНИНИb-Glub-Glub-Glub-Glu (2,1)- b-Glu0,13110210ГорькийМенеегорький82Продолжение таблица 14РебAb-Glub-Glu (2,1)- b-Glu0,80210Лучшестевиозида0,2130Горький200Менеегорький(болеебалансированный)Похож наРебFПохож наРебFb-Glu (3,1)РебA2b-Glub-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (6,1)РебCb-Glub-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu (3,1)РебF(Ксилозил)b-Glub-Glu (2,1)- b-Xylb-Glu (3,1)РебF2(Ксилозил)РебRb-Glub-Glu(1,2)-[b-Xyl(1,3)]Glu(b-НИНИb-Glub-Xyl (3,1)- b-GluНИНИb-Glu (2,1)Дулкозид Аb-Glub-Glu (2,1)- a-Rha0,530ГорькийРебGb-Glub-Glu(3,1)-b-GluНИНИСладкийРебHb-Glub-Glu (2,1)- a-Rha(3,1)- b-GluНИНИСладкийСладкийb-Glu (3,1)РебQb-Glua-Glu(1,4)-b-Glu(1,2)[Glc(b-1,3)]Glc(b-1-НИРебQ3b-Glua-Glu(1,4)-b-Glu(1,3)[Glc(b-1,2)]Glc(b-1-НИ300350НИРебI2b-Glua-Glu(1,3)-b-Glu(1,2)[Glc(b-1,3)]Glc(b-1-НИНИСладкийРебLb-Glub-Glu(1,6)-b-Glu(1,2)[Glc(b-1,3)]Glc(b-1-НИНИСладкийРебA3b-Glub-Glu(1,2)-[ b-Fru(2,3)]Glc(b-1-НИНИСладкийСтевиозид D(Куиновозидил)Стевиозид E(Куиновозидил)Стевиозид E2(Куиновозидил)Стевиозид F(Ксилозил)b-Glub-Qui(1,2)-b-GluНИНИГорькийb-Glub-Qui(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-НИНИГорькийb-Quib-Glu(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-НИНИГорькийb-Glub-Xyl(1,2)-b-GluНИНИПохож настевиозидСладкийДва b-1,2-глюкозных остатка на C-19РебKA(Стевиозид-A)РебEb-Glu (2,1)- b-Glub-GluНОНОНОb-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (2,1)- b-Glu1,70170Слегкагорький;лучшеРебАРебVb-Glu (2,1)- b-Glub-Glu(3,1)-b-Glu83Продолжение таблица 14РебDb-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (2,1)- b-Glu0,03220Слегкагорький;лучшеРебАНОНОНОb-Glu (3,1)РебKb-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu (3,1)РебC (изомер)b-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu(3,1)-b-GluНОНОНОРебSb-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu(2,1)-b-GluНОНОНОРебJ(Рамнозил)b-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu (2,1)- b-GluНОНОНОb-Glu (3,1)РебF3(Ксилозил)Неттривиальногоназвания(Куиновозил)b-Xyl(1,6)-b-Glub-Glu(1,2)-b-GluНОНОНОb-Qui(1,2)-b-Glub-Glu(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-НОНОНОНОНОНОНОНОГоречьоченьмаленькаяНОНОНОb-Glu(3,1)-b-GluНОНОНОb-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (2,1)- b-Glu0,1250b-Glu (3,1)b-Glu (3,1)a-Glu(1,2)-[a-Glu(1,4)]Glc(b1b-Glu(1,2)-[b-Glu(1,6)]Glc(b1b-Glu(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-b-Glu(2,1)-b-Glub-Glu(2,1)-b-Glub-Glu (3,1)- b-GluНОНОНОНОНОНОБлизко ксахару.ОченьнизкаягоречьНОНОНОДва b-1,3-глюкозных остатка на C-19Стевиозид BРебIb-Glu (3,1)- b-Glub-Glu (3,1)- b-GluGlub-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (3,1)РебUb-Glu(1,6)-a-Arab-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (3,1)Три глюкозных остатка на C-19РебWb-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (3,1)РебMРебQ2РебI3РебTb-Xyl(1,2)РебNb-Glu (2,1)- a-Rhab-Glu (2,1)- b-Glub-Glu (3,1)b-Glu (3,1)300350Похож наРебD84Продолжение таблица 14РебOb-Glu (3,1)- b-Glu(2,1)a-Rha (3,1)-b-GluНеттривиальногоназвания(Куиновозил)Неттривиальногоназвания(Ксилизил)b-Glu(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-b-Xyl(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-b-Glu (2,1)- b-GluНОНОПохож наРебNb-Qui(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-НОНОНОb-Glu(1,2)-[b-Glu(1,3)]Glu(b-НОНОНОb-Glu (3,1)Взаимосвязь между структурой и качеством сладости была изучена для некоторыхпроизводных гликозидов cтевии (Esaki et al., 1984; Kamiya et al., 1979).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
