Диссертация (1152197), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Эта единица примернов 25 раза больше соответствующей единицы Тильдена-Хадсона (Hale, Rawlins, 1951).Диспропорционирующая активность ЦГТазРеакционная смесь, содержащая испытуемый препарат фермента, 10 мг растворимогокрахмала, 50мМ сахарозы и 10мМ CaCl2 в 1 см3 0,1М буфера, инкубировали при 40°С в течение10 мин. Реакцию останавливали кипячением и после центрифугирования определяли количествомальтозилфруктозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) наколонке Zorbax-NH2 («Agilent 1100 Series», США) с использованием подвижной фазыацетонитрил-вода (70:30) и дифференциального рефрактометра в качестве детектора. За единицуактивности принимали количество фермента, образующее 1 µмоль мальтозилфруктозы за 1 мин(Akimaru et al., 1991).36Дециклизирующая активность ЦГТаз1,0 см3 реакционной смеси, содержащей фермент, 5мМ b-ЦД, 10мМ CaCl2 в 0,1М буфере(соответствующий рН) и 150 мкг глюкоамилазы, инкубировали при 40оС в течение 10 мин.
Затемопределяли количество редуцирующих сахаров. За единицу активности принимали количествофермента, гидролизующее 1 µмоль b-ЦД в минуту (Akimaru et al., 1991).Трансгликозилирующая активность ЦГТазРеакционную смесь, содержащую препарат ЦГТазы (4,0 ед.), 10 мг растворимого крахмала,50 ммоль сахарозы и 10 ммоль CaCl2 в 1 см3 0,1М буфера (рН 6,5) инкубировали при 50оC втечение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением (10 мин) и после центрифугирования(10000 g, 10-15 мин) определяли количество мальтозилфруктозы методом ВЭЖХ на колонкеZorbax-NH2 («Agilent 1100 Series», США) с использованием подвижной фазы ацетонитрил-вода(70:30) и дифференциального рефрактометра в качестве детектора.
За единицу активностипринимали количество фермента, образующее 1 мкмоль мальтозилфруктозы за 1 мин (Akimaruet al., 1991).Для определения влияния различных ионов металлов на активность ЦГТазы ферментдиализовали против дистиллированной воды в течение 24 ч, преинкубировали в водном раствореионов в течение 30 мин при 50оС и оптимальном рН и определяли остаточную циклизирующуюактивность.Влияние температуры на активность ЦГТазы определяли в реакционной смесиследующего состава: 1 см3 2 %-ного раствора растворимого крахмала, 0,5 см3 1/15М фосфатногобуфера, рН 7,0 и 1 см3 фермента. Смесь инкубировали при разных температурах в течение 15 мини определяли остаточную декстринизирующую активность.Термостабильность ЦГТазы определяли при инкубации 1 см3 раствора фермента в 1 см31/15М растворе фосфатного буфера, рН 7,0 в течение двух часов. Затем определяли активностьпри оптимальной температуре.Влияние рН на активность ЦГТазы изучали в реакционной смеси следующего состава:1 см3 2%-ного раствора растворимого крахмала, 0,5 см3 раствора буфера и 1 см3 фермента.Инкубировали при 50°С в течение 5 мин.Использовали следующие буферные растворы: рН 4,0-6,0 - 0,1Н ацетатный буфер; рН 6,08,0 - 1/15М фосфатный буфер; рН 8,0-10,0 - 0,2М NaOH-глициновый буфер.
Стабильность ЦГТ-37азы к различным рН определяли при выдержке 1 см3 фермента в 1 см3 растворах разных буферовпри рН 4,0-10,0 и температуре 50°C в течение двух часов. Затем определяли активность приоптимальных условиях.2.2.2. Определение трансгликозилирующей активности βфруктофуранозидазыТрансгликозилирующаяактивность b-фруктофуранозидазыопределялиследующимобразом, за единицу активности принимали количество фермента, необходимое для переноса 1мкМ фруктозы за 1 мин в условиях эксперимента (Зинченко и др., 1994).Степень трансгликозилирования (А) определяли по формуле:А (%) = (Присоединённая фруктоза/высвобожденная глюкоза) х100,где количество присоеденённой фруктозы вычисляли по разнице между содержанием глюкозы исвободной фруктозы.Для определения b-фруктофуранозидазной активности, раствор неочищенного фермента(0,5 см3) и 0,5 см3 40% (вес/об) сахарозы в 50мМ фосфатного буфера (рН 6,5), инкубировали при30°С при постоянном перемешивании в течение 10 мин.
Реакцию останавливали кипячением втечение 5 мин, центрифугировали и в надосадочной жидкости определяли количестворедуцирующих сахаров. Количество восстанавливающих сахаров определяли методом реакциис 3,5-динитросалициловой кислотой (DNS). За единицу β-фруктофуранозидазной активностипринимали количество фермента, которое высвобождало 1 мкмоль глюкозы за 1 мин в условияхэксперимента.Количество редуцирующих сахаров определяли методом Сомоджи-Нельсона (Somogyi,1952).Фруктозу и глюкозу идентифицировали спектрофотометрически (Bergmeyer et al., 1974).Количество общих сахаров определяли методом фенол-серной кислоты (Dubois et al.,1959).Количественное определение фруктоолигосахаридов осуществляли методом ВЭЖХ наприборе «Agilent 1100 series» (США) в следующих условиях: колонка – Zorbax-NH2 (5 мкм,4,6x250 мм); подвижная фаза – ацетонитрил-вода (70:30, объем/объем); скорость протока 2см3/мин; детектор - дифференциальный рефрактометр.38Определение гликозидов стевии и их производных проводилось методом ВЭЖХ наприборе «Agilent 1100 series» (США) в следующих условиях: колонка – Zorbax-NH2 (5 мкм, 4,6x250 мм); подвижная фаза – ацетонитрил-вода (70:30, объем/объем); скорость протока 1 см3/мин;детектор – УФ-детектор при 210 нм.Для анализа трансгликозилированных производных гликозидов стевии ЦГТазойиспользовали колонку Zorbax-NH2 (5 мкм, 4,6x250 мм) с подвижной фазой ацетонитрил-вода,метод градиента от 80:20 объем/объем (2 мин) до 50:50 объем/объем в течение 90 мин сиспользованием УФ-детектора при 210 нм.
Скорость протока 1 см3/мин, температура колонки20оC.Определение фруктозилированного РебА (РебA-Fru) проводили методом ВЭЖХ наколонке Poroshell 120 SB-C18 (2,7 мкм, 4,6x150 мм) с подвижной фазой фосфатный буферацетонитрил=75:25 (объем/объем) в течение 40 мин, а затем ацетонитрил-вода=68:22(объем/объем) в течение 20 мин. Скорость протока 1,8 см3/мин, температура колонки 40оC сиспользованием УФ-детектора при 210 нм.Для приготовления фосфатного буфера использовали 0,01М раствор NaH2PO4xH2O и рHдоводили до 2,6 фосфорной кислотой.2.2.3.Идентификациягликозидовметодомвысокоэффективнойжидкостной хромато-масс спектрометрии (ВЭЖХ/МС)Mасс-спектрометрия (МС) основана на анализе ионов, движущихся в вакууме.
В результатемасс-спектры обеспечивают ценную информацию о молекулярной массе, количестве,идентичностиичистотеобразца.MСдобавляетспецифичностькачественногоиколичественного анализа.Для осуществления ВЭЖХ-МС использовали нижеследующие условия:Настройки аппаратаКолонка: Agilent Poroshell 120 SB-C18 (2,7 мкм; 4,6ммx150мм)Температура колонки: 40°CМобильная фаза: Растворы заранее отфильтровывали и смешивали непосредственно переданализом:Раствор А: 25% ацетонитрил и 75% раствор муравьиной кислоты (0,1%)Раствор Б: 32% ацетонитрил и 68% раствор муравьиной кислоты (0,1%)39Таблица 3. Параметры градиента мобильной фазы в колонкеВремя (мин)Мобильная фазаРаствор АМобильная фазаРаствор Б0100013100013,55050140100600100Скорость потока:Инъекция:Обнаружение:0,5 см3/мин2 мклMSD в режиме сканированияMSD НастройкиРежим: ES-API, Отрицательная полярностьСушка газа (поток): 13,0 дм3/минДавление распылителя: 30 psig (фунтов на кв.
дюйм)Сушка газа (температура): 270°CSIM Параметры:Время проведения полного анализа на ВЭЖХ-МС: 60 мин;Интервал после окончания анализа одной пробы и началом анализа следующей: 10 мин;Температура автоматического пробоотборника: 23-24оC.40ГЛАВА 3. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИДОВСТЕВИИВкусовые характеристики и некоторые физико-химические свойства гликозидов могутбыть существенно улучшены добавлением одного или более углеводных единиц к молекуле.Существуют два основных метода такой модификации: трансгликозилирование и конденсация(обратная реакция гидролиза) (рисунок 9) (Fujimoto et al., 1996; Nakano, Kitahata, 2005; Patent USAppl. 2010/0278993, 2010; Prakash et al., 2014a).
Их называют также кинетической и равновесноконтролируемой реакциями, соответственно.Рисунок 9 - Синтетические реакции получения гликозидов(Nakano, Kiso, 2009)Несмотря на то, что конденсация и трансгликозилирование протекают по разныммеханизмам, в обоих случаях степень полимеризации продуктов выше, чем субстратов.Поскольку ферменты являются катализаторами, то они в одинаковой степени должныускорить как прямую, так и обратную реакцию.
Поэтому, любая гидролаза, катализирующаягидролиз гликозидных связей, должна также катализировать образование этих же связей(конденсация) согласно следующему уравнению:где G является глюкозным остатком или молекулой глюкозы, G-G - мальтоза, и kf и kb являютсяконстантами скорости прямой и обратной реакции.Кроме того, равновесные константы гидролитической реакции, Kh, и конденсации, Kc,имеют следующую зависимость:41Kc = 1/Kh = [G-G][H2O]/[G]2 ,= kb/kf ,и следовательно[G-G] = Kc [G]2 / [H2O] = [G]2 / (Kh - [H2O]),где [G] и [G-G] представляют собой концентрации глюкозы и мальтозы в равновесии.Таким образом, для реакций конденсации предпочтительны высокие концентрациисубстратов и низкое содержание воды.
Константа равновесия гидролитической реакции Kh можетбыть выражена не принимая во внимание концентрация воды [H2O], так как Kh′= Kh[H2O], ианалогично, константа скорости kf′ = kf[H2O].Таким образом, с уменьшением количества воды и, следовательно, увеличениемконцентрации глюкозы в реакционной смеси, реакцию можно направить в сторону конденсации,т.е.
реакция имеет четкую концентрационную зависимость (Yamamoto, 1988).С другой стороны, трансферазную реакцию можно описать следующим уравнением:где A – молекула акцептора.Константа равновесия трансферазной реакции Kt может быть описана какKt = [G-A][G]/[G-G][A] = kt/k-tи следовательно[G-A] = Kt [G-G][A]/[G]где kt и k-t являются константами скорости прямой и обратной реакции, соответственно.Субстрат G-G может выступать одновременно в качестве донора и акцептора, в этомслучае, мальтотриоза, G-G-G, будет синтезироваться как продукт трансферазной реакции, G-A.Тенденция возникновения реакции переноса или конденсации в катализируемыхферментами реакциях определяется константой равновесия (Kt or Kc) для данной реакции с однойстороны, и характеристикой фермента, с другой.
Гидролиз является преобладающей реакциейпри низких концентрациях субстрата (Yamamoto, 1988).Реакциятрансгликозилирования широко используетсядля получения различныхгликозидов и олигосахаридов, во время которой гликозильная единица донора переносится к42соответствующему акцептору с образованием новых гликозидных связей. Большинствогликозилтрансфераз только в малой степени катализирует гидролиз, хотя некоторые из них,также классифицированные как трансферазы, обладают достаточно высокой гидролитическойактивностью.
Данная гидролитическая реакция может быть рассмотрена как трансферазнаяреакция, где гликозильный остаток переносится к молекуле воды. В реакциях, катализируемыхгидролазами, трансферные продукты также выступают как субстраты для гидролиза. Поэтому,каждый раз необходимо тщательно контролировать время инкубации и соотношение фермента ксубстрату. С другой стороны, в катализируемых трансферазами реакциях не протекаетсущественный гидролиз продуктов реакции даже после длительной инкубации (Nakano, Kiso,2009).Когда равновесие гидролитических реакций смещается в сторону синтеза путемприменения высоких концентраций субстратов и, следовательно, низких концентрации воды,или же удалением продуктов реакции из реакционной среды, протекает реакция конденсации(Fujimoto et al., 1996).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
