Диссертация (1152197), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Некоторые из нихобладают прекрасными вкусовыми качествами.Три гликозилированные производные получены при обработке стевиозида b-амилазой вприсутствии мальтозы в качестве донора, а именно: (а) b-О-a-глюкозилированное производноепри C-19; (б) b-О-a-глюкозилированное производное при C-13 и (в) 3-O-a-глюкозилированноепроизводное при C-13. Сладость производных (а) и (б) ниже, чем у стевиозида, однако дляпроизводного (а) наблюдалось существенное улучшение вкусовых качеств.
Это является первымпримером улучшения вкуса добавлением глюкозы в позиции C-19-O-глюкозильного остатка. В30принципе, в пищевой промышленности вкусовые качества более важны, чем характерподсластителя и его количество. Компонент (в) обладает горьким привкусом, если дажедополнительно глюкозилировать в позиции С-13 софорозильного остатка (Lobov et al., 1991;DuBois, 1985). Таким образом, тип боковых глюкозных единиц имеет существенное влияние нахарактер сладкого вкуса гликозидов.Обработка декстран сахаразой Acetobacter capsulatus ATCC 11894 смеси стевиозида игидролизата крахмала изоамилазой приводит к образованию моно- и диглюкозил-производныхстевиозида в качестве основных трансглюкозилированных продуктов.
Моноглюкозилпроизводные представляют собой 13-О-[(6-a-глюкозил(2-b-глюкозил)-b-глюкозил]-19-О-bглюкозил-стевиол и 13-О-(6-a-глюкозил-2-b-глюкозил-b-глюкозил-19-О-b-глюкозил-стевиол(SG1 и SG2), а ди-производное - 13-О-(6-a-глюкозил(6-a-глюкозил-2-b-глюкозил)-19-О-bглюкозил-стевиол (2m) (рисунок 6) (Yamamoto et al., 1994). Сравнительная сладость всехполученных соединений была существенно ниже таковой для исходного стевиозида.Рисунок 6 - Транс-a-глюкозилирование стевиозида с помощью декстран сахаразы (Ohtani,Yamasaki, 2002)Обработка стевиозида с помощью трансгликозилирующего фермента Streptoтyces sp.
W191 в присутствии курдлана (линейный b-1,3-глюкан) приводит к образованию трех транс b-1,3глюкозилированных продуктов: (а) SbG1а: 13-O-b-софорозил-19-O-b-ламинарибиозил-стевиол;31(б) SbG1b: b-О-[b-глюкозил-(1,3)- b-глюкозил-(1,2)- b-глюкозил]-19-O-b-глюкозил-стевиол и (в)SbG2: 13-O-b-софорозил-19-O-b-ламинаритриозил-стевиол. Улучшение вкусовых качествотмечается для SbG1а и SbG2, а также смеси продуктов, хотя интенсивность их сладости быланиже, чем у стевиозида (рисунок 7).Рисунок 7 - Транс-a-глюкозилирование стевиозида b-1,3-глюканазой в присутствиикурдлана (Ohtani, Yamasaki, 2002)Обработка стевиозида ферментом Streptoтyces sp.
DIC-108 в присутствии b-1,3-глюканаприводит к образованию РебА.При применении β-фруктофуранозидазы из Arthrobacter sp. и сахарозы в качестве донора,происходиттранс-β-2,6-фруктофуранозилирование19-О-глюкозильногоостатка.Образовавшиеся остатки обладали отличными вкусовыми качествами, однако отличалисьнестабильностью и легко подвергались гидролизу (Ishikawa et al., 1990).Трансгликозилирование гликозидов стевии осуществлено также b-галактозидазой изразличных источников, используя лактозу в качестве донора гликозильных единиц.
Всеферменты образовывали четыре производные: 13-O-b-D-глюкозил-19-О-[b-D-галактозил-1,4-bD-глюкозил]-стевиол(RGal-1);13-O-b-D-галактозил-1,4-b-D-глюкозил-19-О-b-D-глюкозил-стевиол (RGal-2); 13-O-b-D-глюкозил-19-О-[b-D-галактозил-1,6-b-D-глюкозил]-стевиол (RGal3) и 13-O-[b-D-галактозил-1,6-b-D-глюкозил]-19-О-b-D-глюкозил-стевиол (RGal-4). Однако, они32устраняют горечь рубузозида только частично из-за низкого выхода производных с требуемымикачественными характеристиками (рисунок 8) (Kitahata et al., 1989b).Рисунок 8 - Продукты трансгликозилирования рубузозида с помощьюb-галактозидазы (Kitahata et al., 1989a).Наилучшие результаты получены при трансгликозилировании с помощью ЦГТазмикробного происхождения, таких как Bacillus macerans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillusmegaterium и других с использованием крахмала (донор) (Fukunaga et al., 1989; Patent US4,219,571,1980).Врезультатеобразуютсяα-1,4-глюкозил-производные,причемтрансглюкозилируются как 13-О-, так и 19-О-глюкозильные остатки в молекулах стевиозида ирубузозида.
Практически все полученные производные обладают улучшенными вкусовымикачествами (Abelyan, 2005; Kasai et al., 1981; Ohtani et al., 1991).Наилучшие результаты получаются при удлинении глюкозидной цепи в позиции C-13 до 4единиц, с неизменностью позиции C-19. Любое присоединение глюкозила к положению C-19приводит к ухудшению вкусовых качеств производных. Наилучшими вкусовыми качествами каксреди компонентов экстракта, так и его производных обладают моно- и ди-глюкозилированныепроизводные, которые могут быть получены селективно и использованы в качествепревосходных заменителей сахара.Для улучшения вкусовых характеристик, продукт обрабатывают b-амилазой с цельюгидролиза высокомолекулярных производных стевиозида и очищают хроматографическимпутем. Основными компонентами полученной смеси являются моно- и диглюкозилированныеварианты стевиозида (Kasai et al., 1981; Kitahata, 2001; Patent Japan 03-83558, 1991; Patent Japan03-262458, 1991; Patent US Appl.
201110023192, 2011; GRAS assessment, 2011).33Обобщая далеко не исчерпывающий обзор литературы по сладким гликозидам Steviarebaudiana Bertoni, можно сделать следующее заключение:- Гликозиды Stevia rebaudiana Bertoni имеют не только интенсивный сладкий вкус, но иоказывают определенное оздоровительное влияние на организм.- Разработано множество методов их выделения из листьев, однако существуютопределенные трудности при их полной экстракции и тонкой очистке.- Нет систематических и сравнительных исследований по модификации гликозидовразличными ферментами и изучение взаимосвязи между структурными особенностямимодифицированных производных и вкусовыми качествами.- Разработка эффективных методов выделения и очистки некоторых минорных гликозидов,обладающих отменными вкусовыми характеристиками, становится насущной необходимостью.- Разработка эффективных методов трансгликозилирования и получение производных снаилучшими вкусовыми характеристиками поможет создавать оптимизированные смеси,соответствующие требованиям пищевой промышленности для отдельных видов продуктов, исладость которых наиболее близка к сахару.34ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙОбьектом исследования служилa стевия (Stevia rebaudiana Bertoni).2.1. Ферменты ЦГТаза и β-фруктофуранозидазаВ качестве продуцента цикломальтодекстрин глюканотрансферазы (ЦГТазa) былиспользован Geobacillus stearothermophilus St-88 из коллекции культур микроорганизмовкомпании PureCircle Ltd.
(Малайзия).В качестве продуцента β-фруктофуранозидазы использовали штамм Arthrobacter sp. (K-1)FERM BP-3192 из коллекции культур NBRC (IPOD), Япония.Выращивание штаммов в глубинных условиях осуществляли на качалках типа Certomate IS(B. Braun Biotech. Int., Германия) и в ферментере Biostat B (B. Braun Biotech. Int., Германия) наследующих питательных средах:Культура-продуцент ЦГТазGeobacillus stearothermophilus (г/ дм3): Крахмал – 7,0; кукурузный экстракт – 5,0; NH4Cl –5,3; CaCO3 – 2,5 (рH 6,5; 56°C) (Абелян и др., 2002).Культура-продуцент β-фруктофуранозидазыArthrobacter sp. K-1 (г/ дм3): Кукурузный экстракт – 5,0; сахароза – 3,0; (NH4)2HPO4 – 0,4;MgSO4x7H2O – 0,1 (рH 7,0; 37°C) (Fujita et al., 1990).β - амилазаИспользовали ферментный препарат β – амилаза #1500S (Nagase, Япония), активность 1500ед/г.ГлюкоамилазаИспользовали ферментный препарат глюкоамилазы Glucoamylase AMG 300L, aктивность300 ед / см3, Novozyme, Дания.352.2.
Определение ферментативной активности2.2.1. Определение ферментативной активности ЦГТазЦиклизирующая активность ЦГТазМетод основан на специфическом определении a-ЦД. К 1 мл 3%-ного раствора крахмала(оптимальный рН) добавляли 0,5 см3 фермента и смесь инкубировали при оптимальнойтемпературе. Через определенные интервалы времени 3 капли реакционной смеси смешивали с1 каплей раствора 0,1N I2 в 0,1М KI и после фиксации на предметном стеклемикроскопированием определяли наличие a-ЦД.
С появлением гексагональных кристалловреакцию считали законченной. За единицу активности принимали количество фермента, котороетрансформирует 1 см3 3%-ного раствора крахмала за 30 мин (Tilden, Hudson, 1942).Декстринизирующая активность ЦГТазК 10 см3 2%-ного раствора крахмала с оптимальным значением рН добавляли 4 мл растворафермента и инкубировали при оптимальной температуре. Через определенные интервалывремени отбирали 0,5 см3 пробы и приливали раствор 0,0035М I2 в 0,26М KI в количестве 5 см3.Объем раствора доводили до 10 см3 дистиллированной водой и через 3 мин определялиоптическую плотность при 660 нм. За единицу активности принимали количество фермента,которое за 10 мин в условиях эксперимента конвертирует 50% крахмала.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
