Автореферат диссертации (1151582), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Учитывали возраст и половую принадлежностьживотных, так как организм половозрелых самцов кроликов имеет стабильныйгормональный фон и достоверные отличия биохимических показателей крови всравнении с самками (Малинин М.Л., Тихомирова Е.И., Обух Л.Б. и др., 2008).Возраст кроликов устанавливали по данным регистрационных записей журналовучёта зооветслужб хозяйств.КФХ «Раздолье» Тюльганского района и КФХ «Зобнин» Кваркенского районаОренбургской области находятся в благополучной зоне по инвазионным иинфекционным заболеваниям.
В каждом хозяйстве, в течение всегоэкспериментального периода, животные содержались по группам в одинаковыхусловиях и обслуживались одним кролиководом. Кормление животныхосуществляли по нормам ВИЖа.10Кроликам контрольной группы не применяли препараты, их не подвергалистрессу, животные содержались в отдельных стандартных односекционныхклетках (площадь пола 0,84м2) в помещении, защищенном от солнечных лучей, схорошей вентиляцией.Эксперимент с моделированием стрессового состояния у животных первойопытной группы производили в течение 14 суток, с использованием уплотненнойпосадки и теплового климатического фактора (33±2°С).Кролики экспериментальных групп (первой, второй и третьей) находились вклетках под открытом небом, за стеной - преградой розе ветров (площадь полаобщего стада на одну голову составляла 0,14 м2). Самцам кроликов второйопытной группы перед постановкой на эксперимент – вводилипрепарат®«Ронколейкин » из расчета 5000 МЕ/кг массы тела, трёхкратно, один раз в сутки, синтервалом 48 часов.
Третью инъекцию препарата «Ронколейкин®» производили впервые сутки эксперимента. Животным третьей опытной группы вводили препарат«Гамавит» курсом за 8, 6, 4 суток – до, и в первые сутки воздействия стрессфакторов, из расчета 0,1 см3/кг массы тела.Объектом исследования служили селезёнка и кровь клинически здоровыхполовозрелых самцов кроликов, и экспериментальных животных (первой,второй и третьей группы).Материал для исследования получали при убое у самцов кроликов, схозяйственной целью, непосредственно перед убоем проводили визуальную иклиническую оценку их состояния (t°С, ЧДД, ЧСС).
Отбор проб крови проводилииз краевой ушной вены для морфологического и биохимического исследований,определения в сыворотке крови концентрации гормонов: кортизола и ДГЭА-С.Гистологические пробы осуществляли поствитально (не менее чем от трех голов),не позднее одного часа после убоя.Все процедуры с животными в эксперименте проводили в соответствии спротоколами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных,используемых для экспериментальных и других научных целей» (EuropeanCommunities Council Directive (86/609/EEC), с требованиями нормативныхправовых актов, регламентирующих выполнение иcследований по безопасности иэффективности фармакологических веществ в РФ (Приказ МЗ РФ «Обутверждении правил лабораторной практики» №267 от 19.06.2003 г.) изаконодательством Российской Федерации (Национальный стандарт ГОСТ Р53434-2009).Экспериментальная часть включала в себя следующий комплексисследований:Анатомические исследования.
Определение массы животных, после убоя.Топографические исследования селезёнки: голо-, скелето- и синтопия.Определение формы, абсолютной и относительной массы селезёнки, измерениедлины, ширины, толщины органа. С целью глубокого исследования анатомо-11топографических особенностей селезёнки проводили поперечные распилы труповживотных по Н.И. Пирогову. На пластинах выявляли синтопию селезёнки.Кровеносные сосуды селезёнки изучали методом коррозии, их инъекциюосуществляли раствором измельчённого прессованного товарного целлоидина вацетоне.
Сосуды селезёнки мелких животных (в связи с малым диаметромсосудов) инъецировали через чревную артерию. Инъекцию селезёночной веныосуществляли в области её отделения от воротной вены раствором целлоидина,подкрашенного метиленовой синью. Инъецированные препараты выдерживали 24часа в холодной воде, затем погружали в концентрированную техническуюсоляную кислоту, до полного разрушения тканей органа. После коррозии, препаратизвлекали из кислоты и промывали под слабой струей проточной воды, затемвысушивали при комнатной температуре.Инъекцию сосудов латексом осуществляли через чревную артерию – умелких животных и непосредственно в селезёночную артерию - у крупныханалогично методу коррозии. Инъекцию венозных сосудов органа проводили черезселезёночную вену.
Инъецированный препарат помещали на пять дней в 3%раствор формалина, и в течение 15 дней постепенно доводили его концентрацию до15%. Экстра- и интраорганные сосуды селезёнки исследовали методами тонкогопрепарирования по В.П. Воробьеву (1958). Внутренний диаметр крупных артерий ивен измеряли при помощи цифрового штангенциркуля с ценой деления 0,01мм,мелких - окулярной линейкой микроскопа МБС–9.Длярентгеноангиографическогоисследованияприменялирентгеноконтрастный состав для наливки кровеносных сосудов на основесвинцового сурика (Ильгеев С.Т., Тайгузин Р.Ш., Жанабеков У.М. и др.,1989), атакже смеси сернокислого бария и латекса. Рентгенографию сосудов селезёнкипроводили на аппарате РУМ – 4 при экспозиции 0,15 – 10,0 с и напряжения тока45-71кВт. Фотографирование препаратов - с помощью цифровой фотокамеры“Nicon ”.Гистологические исследования.Материаломдляисследованиягистоархитектоники селезёнки служили гистологические образцы (0,05-1,0 см³)органа животных, которые отбирали в различной проекции в области ворот - спариетальной и висцеральной поверхности, с захватом капсулы, и в срединнойчасти органа.
Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина илив специальном молекулярном растворе, после стандартной гистологическойобработки (проводка через батарею спиртов возрастающей крепости), заливали вцеллоидин-парафин. Полученные гистосрезы, толщиной 5-6 мкм, окрашивалигематоксилином Майера и эозином, по Романовскому-Гимза, углеводсодержащиебиополимеры выявляли по Хочкису (Hotchkiss R.D., 1948), визуализацию РНКядрышек и цитоплазмы по методу Браше (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996).Световую микроскопию выполняли при помощи микроскопа Micros MSD 500(Австрия), оснащенного цифровой камерой.12Цитологические исследования.
Пробы селезёнки (0,025 см3 - дляизготовления ультратонких срезов), фиксировали в охлажденном 2,5% раствореглютарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4). После общепринятойподготовки и дегидратации материала, пробы помещали в смесь эпон-аралдит.Полутонкие срезы, толщиной 0,07-0,008мкм, изготавливали на ультратоме LKB V(Швеция), окраску, которых проводили 1,0% раствором толуидинового синего,приготовленного на 2,5% безводной соде. Электронную микроскопию производилина электронном микроскопе JEM – 7A (Япония).Морфометрическиеисследования.Выполнялидляполученияколичественной информации о линейных размерах, диаметрах лимфоидныхструктур селезёнки, её экстра- и интраорганных сосудов ГМЦР, а также осоотношениях площадей структурных компонентов использовали винтовой окуляр- микрометр МОВ-1-15х1500 (ГОСТ 15150-69) и лицензионную программу «ТестМорфо-4.0». Гистостереометрические исследования по удельным площадямгистологических структур проводили с помощью окулярных вставок: контрольныхточек для работы по исчислению объема структур, измерительных линеек.
Вотдельном образце ткани измерение каждого показателя, осуществляли не менеечем в 16 полях зрения каждого объекта (Автандилов Г.Г., 1990). Лимфоидныеузелки селезёнки классифицировали по диаметру: крупный – от 500 мкм и выше,средний – от 200 мкм до 500 мкм, мелкий – до 200 мкм.Гематологические исследования: количество гемоглобина, эритроцитов,лейкоцитов определяли – гематологическим анализатором Medoniс СА 620.Прибор использует для измерения гемоглобина – колориметрический метод, а дляподсчета клеток и определения их размеров кондуктометрический метод.Дифференциальный подсчет лейкоцитов – (гранулоциты и агранулоциты) вокрашенных мазках крови по Романовскому-Гимзе (Кондрахин И.П., КуриловН.В., Малахов А.Г. и др., 1985).Биохимические исследования крови: общий белок сыворотки крови побиуретовой реакции, белковые фракции (α, β, γ) – фотоэлектроколориметрически.Активность щелочной фосфатазы – спектрофотометрированием.
Концентрациюглюкозы с помощью набора «ГЛЮКОЗА-ФКД». Определение концентрациикальция комплексометрическим методом, фосфора – с ванадат-молибденовымреактивом. Активность АсАТ и АлАТ – динитрофенилгидразиновым методом(Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и др., 1985). Коэффициент де Ритисавычисляли исходя из соотношения: АсАТ / АлАТ (Медведева М.А., 2008).Определение концентрации гормонов в сыворотке крови: кортизола идигидроэпиандростерона-сульфат(ДГЭА-С)методомтвердофазногоиммуноферментного анализа (ИФА) на спектрофотометре «Multiscan Labsystems»(Финляндия), с использованием стандартных наборов реагентов: для кортизола «ИФА – кортизол», для ДГЭА-С – «ИммуноФА-ДГЭА-С» (Москва).Статистическая обработка. При помощи программы «Microsoft OffiseExcel» на персональных компьютерах Intel Celeron D и компьютере AMD Athlon13(tm) XP 1800+ в операционной среде Windows XR Professional, все полученныеколичественные параметры подвергали вариационно-статистической обработке:вычисление средней величины, вероятность её ошибки по t-критериюдостоверности Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990), выявленные взаимовлиянияпоказателей гистоструктур селезёнки через коэффициенты парной корреляции(Автандилов Г.Г., 2002).Приготовление гистопрепаратов, исследование гистоструктуры селезёнки,морфометрию ее структур, статистическуя обработку полученных данных и ихкорреляционный анализ проводили в условиях кафедры морфологии, физиологии ипатологии ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
