Автореферат (1151567), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Список литературы включает 134источников, из них 45 отечественных и 89 зарубежных.2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯМатериал и методы исследованияИсследования выполнены на кафедре анатомии и гистологии животныхимени профессора А.Ф. Климова ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имениК.И. Скрябина, а также на базе центра ветеринарной клеточной медицины впериод с 2014 по 2017 гг. Объектом исследования являлись 55 кроликов (110глаз) породы серый великан, массой 2,5-3,0 кг, в возрасте от 8 до 10 месяцев,подобранных по принципу аналогов. Животных предварительнокарантинировали в течение 7 дней, осуществляли ежедневный клиническийосмотр, было сформировано 5 групп животных. Каждой группесоответствовал исследуемый тип клеток: первой группе животныхинъецировали аллогенные стволовые клетки лимба; второй группе животных— аллогенные мезенхимные стволовые клетки жировой ткани; третьейгруппе — клетки аутологичной стромально-васкулярную фракции.За 14 дней до проведения эксперимента у животных групп 2 и 3 подобщей анестезией производили биопсию жировой и лимбальной ткани дляпоследующего выращивания стволовых клеток на питательных средах.У животных, которым планировали вводить клетки стромальноваскулярной фракции, под местной анестезией производили взятие биоптатажировой ткани.
Полученные после липосакции образцы подвергалиферментативной обработке коллагеназой. Из суспензии отдельных клетокпутем центрифугирования выделяли осадочную фракцию клеток стромальноваскулярного фенотипа, состоящую в основном из CD34+ клеток с примесью6CD45+ лейкоцитарных клеток и эритроцитов. Четвертой группе животных(контрольная группа) вводили физиологический раствор (Sol. Natrii Chloridi0,9%), для оценки реакции тканей.
Пятая группа животных была интактной.Перед трансплантацией в условиях лаборатории суспензию клетоктщательно отмывали от культуральной среды, подсчитывали количествожизнеспособных клеток и суспензировали в минимальном количествефизиологического раствора.У всех животных проводили кератоэктомию под контролемоперационного микроскопа фирмы Opton с коаксиальным и боковымосвещением. Увеличение на разных этапах операции варьировало от 6 до 14.Для иссечения роговицы применяли трепаны диаметром 6,5 мм, с дозируемойглубиной режущей кромки и шагом в 10 микрон. Для расслаивания тканейроговицы применяли лейкосапфировые округлые микролезвия. Основныемоменты операции послойной кератоэктомии осуществляли по общепринятойметодике, описанной Дроновым М.М.
(2002).На центральную зону роговицы устанавливали трепан диаметром 6,5 ммс ограничением трепанации до 200 мкм. Роговичным расслаивателемпроводили переднюю кератоэктомию в пределах трепанационной зоны. Вподопытных группах производили субконъюнктивальную инъекциюсуспензии стволовых клеток в 0,2 мл физиологического раствора.Клинические методы исследования включали осмотр переднего отрезкаглаз с помощью фокального и бокового освещения и биомикроскопиющелевой лампой фирмы «Shin» с флюоресцеиновой пробой ифоторегистрацией.
Оценку состояния глаз проводили на 3, 7 и 14 сутки послетрансплантации по следующим признакам: степени выраженностивоспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, интенсивностипомутнения роговицы. Площадь дефекта стромы роговицы определяли спомощью биомикроскопии. Диаметр поврежденной области роговицыопределяли с помощью роговичного циркуля по Кастровьехо. Интенсивностьпомутнения роговицы оценивали по шкале Войно-Ясенецкого.На 15 день исследования животным была проведена энуклеация глазныхяблок с целью выявления морфофункциональных изменений в роговице послетрансплантации стволовых клеток.Содержание, уход и эвтаназию животных осуществляли согласнотребованиям приказов МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г., № 701 от 27.07.1978 г.,«Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержаниюэкспериментально-биологических клиник (вивариев)», «Европейскойконвенции по защите позвоночных животных, используемых дляэкспериментальных и других научных целей» (1986) и «Хельсинскойдекларации всемирной медицинской ассоциации» (1964).Гистологические исследования проводили по классической методике(Меркулов Г.А., 1956).
Светооптическое изучение гистологических срезов,окрашенных гематоксилином и эозином, а также толуидиновым синим имикрофотосъемку проводили при помощи светового микроскопа Jenamed-27(Carl Zeiss, Jena, Germany), совмещенного с системой цифровой микроскопииImagScope C (ООО «Системы для микроскопии и анализа»).Микроскопическуюморфометриювыполнялиспомощьюсертифицированной программы ImagScope C (ООО «Системы длямикроскопии и анализа»), совмещенной с микроскопом Jenamed-2.Определяли общую толщину роговицы в лимбальной и центральной зонах, атакже отдельно толщину всех слоев роговицы.Статистическую обработку морфометрических данных осуществляли спомощью программы ImagScope C (ООО «Системы для микроскопии ианализа»), оценку статистической значимости различий исследуемыхпоказателей — с использованием критерия Стьюдента.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХОБСУЖДЕНИЕМорфологические и морфометрические характеристики роговицыглазного яблока кролика в контролеПри визуальном исследовании состояния глаза кролика в нормеустановлено, что роговица имеет сферическую форму, она прозрачная,гладкая, блестящая, не содержит кровеносных сосудов, покрыта слёзнойплёнкой.Микроструктура роговицы у контрольных животных соответствуетобщим закономерностям организации этой части глазного яблока.Центральная часть дифференцирована на: наружный эпителиальный пласт,представленный многослойным плоским неорговевающим эпителием из 5-7слоёв клеток; боуменову мембрану, в структуре которой находится слойуплотнённых пучков коллагеновых волокон; собственное вещество,образованное аваскулярной плотной оформленной соединительной тканью свыраженными межволоконными пространствами; десцеметову мембрану,сформированную плотно упакованными пучками коллагеновых волокон;внутреннего эпителиального пласта — однослойного эпителия, с клеткамиполигональной формы.Отличительной особенностью cтроения лимбальной зоны являетсяотсутствие боуменовой мембраны и наличие хорошо развитогосубэпителиального слоя из рыхлой соединительной ткани с кровеносными илимфатическими сосудами, многочисленными фибробластами, а такжестволовыми клетками, являющимися, как известно, источником регенерациироговицы (Борзенок С.А., Тонаева Х.Д, 2012).Особенности заживления роговицы глаза у животных контрольнойгруппы (самопроизвольное заживление)Клиническая картинаНа 3 сутки у кроликов контрольной группы наблюдали выраженныйокулярный дискомфорт с признаками блефароспазма, фотофобии и эпифоры.Имели место острый отек конъюнктивы, ее гиперемия, блефаромейбомиит.Роговица в зоне дефекта была воспалена и отечна, у одного животного8присутствовала кератомаляция, а также признаки реактивного иридоциклита.Окрашивание роговицы флюоресцеином наблюдали у всех животных, степеньеё помутнения по шкале Войно-Ясенецкого составила от 4 до 10 баллов.На 7 сутки эксперимента окулярный дискомфорт был выражен вменьшей степени.
Наряду с этим на фоне сохранения умеренной гиперемииснижались признаки отёка век и конъюнктивы (рисунок 1 А, Б). Признакиреактивного увеита были сохранены (рисунок 1 А, В), а у животного скератомаляцией наблюдали формирование рубцовой ткани (рисунок 1 А).Поверхностное окрашивание роговицы флюоресцеином имело местопрактически у всех контрольных особей. Степень помутнения по шкалеВойно-Ясенецкого составила от 3 до 10 баллов.БВАРисунок 1. Состояние роговицы у животных контрольной группычерез 7 суток после нанесения дефекта (самопроизвольное заживление).А – уплотнение воспаленных тканей роговицы в зоне повреждения, формирование лейкомы,Блефаромейбомиит (синяя стрелка) и реактивный иридоциклит сохранены (зеленая стрелка);Б – неоваскуляризация роговицы с периферии в медиальном секторе (синий указатель),гиперемия пальпебральной конъюнктивы (зеленая стрелка), положительная флюоресцеиноваяпроба;В – слабоположительное прокрашивание флюоресцеином, инъекция сосудов радужнойоболочки (зеленый указатель).На 14 сутки наблюдений у кроликов сохранялись окулярныйдискомфорт и блефаромейбомиит (рисунок 2 А, Б, В), а также гиперемияконъюнктивы (рисунок 2 В).
В то же время уменьшалась степеньвыраженности признаков реактивного увеита. Поверхностное окрашиваниероговицы флюоресцеином было сохранено у двух особей (рисунок 2 А, Б). Увсех животных идентифицировались границы трепанационной зоны, а степеньпомутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого составила от 3 до 9 баллов.АВБРисунок 2 Состояние роговицы у животных контрольной группына 14 сутки наблюдений (самопроизвольное заживление).9А – положительное флюоресцеиновое прокрашивание, формирование рубца по типу лейкомы,сохранение блефаромейбомиита (зеленый указатель);Б – положительное флюоресцеиновое прокрашивание в центральной зоне дефекта, воспаление иотечность век (зеленый указатель);В – формирование рубца в зоне повреждения по типу нубекулы, гиперемия и отекпальпебральной и бульбарной конъюнктивы (зеленый указатель).Результаты морфологических исследованийПо данным морфологического исследования на 7 сутки отмечалиэпителизацию периферических зон дефекта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
