Диссертация (1151502), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Скарификацию осуществляют скальпелем, делая 10-15линейных поверхностных надрезов эпидермиса на выбритом участке кожи допоявления следов крови или нанося несколько параллельных царапин40препаровальной и остро заточенной иглой. При наличии в патологическомматериале возбудителя дерматофилеза, у кролика через 2-3 суток возникает гиперемия, отек зараженного участка кожи, а через 7-8 дней он некротизируется,образовавшаяся корка трескается от движений животного, легко снимаетсяпинцетом. Если корки удалить на 7-8-й день после заражения, они вновьобразуются в результате высыхания кашицеобразного налета, находящегосяпод коркой. В мазках-отпечатках с нижней поверхности как первичных, так ивторичных корок всегда обнаруживается D. congolensis.
Корочки асептическиудаляют и из них на питательных средах изолируют чистую культурувозбудителя дерматофилеза [144].Следует отметить, что суспензию из корок можно наносить и на скарифицированную поверхность уха животного [149].Как известно из данных многих исследователей, кровь больныхдерматофилезом животных содержит специфические антитела. Поэтому длядиагностикидерматофилезамогутбытьиспользованытакжеииммунологические методы исследования.В.А. Балабановым совместно с Л.Л. Черятниковым (1980) был разработанметод серологической диагностики дерматофилеза с помощью реакциидиффузионной преципитации (РДП). Антиген для реакции готовили из 8-10дневной культуры D. congolensis, выращенной в триптиказсоевом бульоне,содержащем 10% сыворотки крови крупного рогатого скота. После отделениябактериальной массы путем центрифугирования надосадочную жидкостьобрабатывали при 4 °С ацетоном в соотношении 1:9.
Осадок, выпавший поддействием ацетона, промывают охлажденным до 4 °С эфиром, который затемудаляется с помощью выпаривания при 30 °С, а осадок растворяют вфизиологическом растворе, доводя объем жидкости до 0,1 от первоначального.Полученный в результате раствор являлся антигеном для РДП [7].РДП авторы ставили с сыворотками от крупного рогатого скота, овец,41лошадей и зебу, больных дерматофилезом в различных стадиях развитияболезни.Исследователи установили, что антигены специфичны и с сывороткамиот больных дерматофилезом животных дают полосы преципитации в титрах до1:64.
Таким образом, было показано, что РДП можно применять длядифференциациидерматофилезаотдругихболезней,протекающихспоражениями кожи.C.G. Gitao в Кении для выявления D. congolensis использовалиммуноферментный твердофазный анализ ELISA, в основе которого лежитметод двойного связывания. В методе двойного связывания первая реакцияпроисходит между определяемым IgG верблюдов и очищенным антигеномвозбудителя, фиксированным к поверхности лунок микропланшета.
Послезавершения первой реакции планшет отмывается. При этом несвязавшиесякомпоненты исследуемой пробы удаляются, а на стенках лунок остаетсякомплекс антиген-антитело. Для выявления образовавшихся иммунныхкомплексов проводят вторую иммунологичесую реакцию, в которой в качествеантигена выступает связавшийся специфический Ig, а в качестве антител кнему – коньюгат, представляющий собой меченные ферментом пероксидазойантитела овец. После завершения второй иммунологической реакции следуетотмывка лунок планшета от избытка коньюгата и далее – третий этап –ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулыконьюгата.Послеостановкиферментативнойреакциипроводятфотометрирование лунок. Далее с учетом значений оптической плотностиконтрольных проб проводят математическую обработку результатов анализа. Вобщем случае, чем выше оптическая плотность в данной лунке, тем большееколичество специфических антител содержалось в соответствующей пробе и,следовательно, выше титр анализируемой сыворотки.
При отсутствии всыворотке исследуемых антител лунки остаются неокрашенными [115].422. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Материалы и методыРабота проводилась в период с 2011 по 2014 гг. на кафедрах паразитологиииветеринарно-санитарнойэкспертизыФГБОУВО«Московскаягосударственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий – МВАимениК.И.Скрябина»,ветеринарно-санитарнойэкспертизыибиоэкологической безопасности ФГБОУ ВПО «Московский государственныйуниверситетпищевыхпроизводств»сиспользованиемматериально-технической базы животноводческих хозяйств и мясокомбинатов в Иордании.Дерматофилез овец изучали в 17 хозяйствах частного сектора в разныхрегионах Иордании, неблагополучных в эпизоотическом отношении по этойболезни и на боинских предприятиях, где проводили убой выбракованногопоголовья овец.Объектами исследования были овцы, больные дерматофилезом вИордании и образцы мяса (баранины), отобранные после убоя на боенскихплощадках в Иордании больных овец.Отбор и подготовку проб мяса проводили в соответствии с ГОСТ 7269-79«Мясо.
Отбор образцов и органолептические методы определения свежести» иПравилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветсанэкспертизы мясаи мясных продуктов (1988).Лабораторный анализ отобранных образцов баранины проводили вветеринарных лабораториях, лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизыв Иордании, а также на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы ибиоэкологической безопасности ИВЭСиЭ ВГБОУ ВО МГУПП.Всего было исследовано 176 специально отобранных проб мяса ивнутренних органов от 22 больных дерматофилезом овец, которые исследовалив трехкратной повторности. Контролем служили продукты убоя 8 здоровыховец, подобранных по принципу аналогов для больных дерматофилезомживотных.432.1.1.
Методы клинико-гематологических исследованийКровь у животных брали из яремной вены и определяли количествоэритроцитов, лейкоцитов, скорость оседания эритроцитов, концентрациюгемоглобина, резервную щелочность и общий белок сыворотки крови пообщепринятым методом.Методы иммунобиологических исследований. В сыворотке кровиисследовали активность лизоцима, иммуноглобулинов G и M классов,бактерициднуюактивность(Е.С.Воронин,2002).Уровеньфагоцитозаопределяли модифицированным методом Лейрира с использованием взвесисуточной культуры E.сoli 0111.
Экспозиция крови (0,5 мл) и взвеси культуры500 млн./мл (0,5мл) в термостате (37˚C) составляло 30 мин. По результатоммикроскопирования мазков крови, приготовленных после экспозиции втермостате, фагоцитарную активность нейтрофилов выражали следующимипоказателями:процентфагоцитоза-отношениечислафагоцитов,захватывавших тест-микробы к общему числу подсчитанных; фагоцитарныминдексом - среднее количество бактерий, захваченных одним нейтрофилом;процент переваривания - отношение числа переваривающихся микробов кчислу всех фагоцитарных.При определении количества лизоцима в сыворотке крови предварительноготовили смесь 1%-ного раствора агара «Дифко» и ацетонового порошкаMicrococcus Iysodecticus в соотношении – 20 мг порошка на 10 мл агара,который разливали слоем 4 мм на органическом стекле.
После застывания агараи нем вырезали луночки диаметром 5мм, куда вносили 5‒кратное разведениеисследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл. Параллельно в лунки вносилирастворы стандартного кристаллического лизоцима в концентрации от 0,5 до100 мкг/мл.После 48‒часовой инкубации во влажной камере при температуре 22‒27 ˚Cизмеряли зоны лизиса вокруг лунок, вызванные сывороткой и различными44концентрациями стандартного лизоцима. Сопоставляя полученные данные,определяли концентрацию лизоцима, которую умножали на степень разведенияи выражали в мкг/мл.Для определения бактерицидной активности сыворотки крови, в рядоткалиброванных по светопропусканию пробирок, вносили по 1,8 млмясопептонного бульона (МПБ), КУДА ДОЛИВАЛИ ПО 0,4 мл исследуемойсыворотки. В контрольные пробирки вносили по 2,2 мл 2,5 млрд.
взвесисуточной культуры E.coli, шт. 0111. На фотоэлектроколориметре при зеленомсветофильтрепротивдистиллированнойводыопределялиоптическуюплотность содержимого опытных и контрольных пробирок (Д1) после чего всепробирки инкубировали в термостате в течение 2,5 ч при температуре 37 ˚C.Послеинкубацииповторноопределялиоптическуюплотность(Д2)содержимого всех пробирок.Бактерицидную активность исследуемых проб сыворотки крови выражалив процентах, вычисляя по формуле:100 ‒ (Д2 опыт. ‒ Д1 опыт.) / (Д2 контр. ‒ Д1 контр.) × 100.Образцысыворотокхраниливпластиковыхпробиркахвнизкотемпературном холодильнике и размораживали перед исследованиями.Результаты обрабатывали статистически и сравнивали между собой, атакже с соответствующими показателями клинически здоровых животных,находящихся в аналогичных условиях содержания.2.1.2.
Методы органолептической оценки мясаПри органолептической оценке мяса овец (баранины) определяливнешний вид, цвет, консистенцию, запах мяса, состояние подкожного икостного жира, состояние сухожилий, качество бульона после варки мяса.Качественные показатели: внешний вид, аромат, вкус, консистенцию(нежность, жесткость) и сочность оценивали по 9-балловой шкале и согласноГОСТ 9959-91. Затем давали общую оценку качества мяса.45Внешний вид туши и цвет мяса определяли внешним осмотром. Вид ицвет мышц на разрезе определяли в глубинных слоях мышечной ткани насвежем разрезе.
При этом устанавливали наличие липкости путем ощупыванияи сочность поверхности мяса на разрезе приложением к ткани кусочкафильтровальной бумаги.На свежем разрезе туши или испытуемого образца легким надавливаниемпальца определяли консистенцию. При этом отмечали время выравниванияямки.Аромат или запах мяса устанавливали сначала в поверхностном слоетуши или испытуемого образца, затем чистым ножом делали разрез и сразуопределяли запах в глубинных слоях. При этом особое внимание обращали назапах мышечной ткани, прилегающей к кости.Состояние жира определяли в туше в момент отбора образцов,устанавливая цвет, запах и консистенцию.Состояниесухожилийопределяливмоментотбораобразцов.Ощупыванием сухожилий устанавливали их упругость, плотность и состояниесуставных поверхностей.Прозрачность и аромат бульона определяли согласно ГОСТ 7269-79.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
