Диссертация (1151469), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Методы исследованийУ каждого животного определяли стандартные физиологическиепоказатели состояния организма. В пробах сыворотки крови животныхопределяли уровень показателей азотистого и белкового, липидного,углеводного, водно-электролитного и минерального обменов, активностьферментов на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Chem-7»(ФРГ, ERBA DIAGNOSTICS MANNHEIM GmbH) с использованиемреактивов«ОльвексДиагностикум»(Россия)и«Human»(ФРГ)идинамическое поверхностное натяжение на тензиометре ВPA-1P (MaximumBubble Pressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies) по методам,описанным ниже.Определение физиологических показателей состояния организмаДля контроля за состоянием здоровья животных всех исследуемыхгрупп перед началом эксперимента определили температуру, частоту55сердечных сокращений (частоту пульса), частоту дыхательных движений пообщепринятым методикам [44, 112, 113].Методы определения физиолого-биохимических параметровазотистого и белкового обменовСодержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовымметодом.
Он основан на том, что белок образует окрашенный комплексфиолетового цвета с ионами меди в щелочной среде. Интенсивность окраскипропорциональна концентрации белка в пробе [51,52, 67, 106].Уровеньальбуминовопределялиунифицированнымколориметрическим методом с бромкрезоловым зеленым. Альбуминыобразуют окрашенный в синий цвет комплекс с бромкрезоловым зеленым вслабокислой среде в присутствии детергента [52, 67].Количество мочевины определяли уреазным-глутаматдегидрогеназнымкинетическим методом.Он основан на оптическом тесте Варбурга сиспользованием сопряженных ферментативных реакций, приводящих кобразованию в инкубационной среде NAD:мочевина + H2Oуреаза2 NH3 + CO2NH3 +α-кетоглутарат + NADH2глутаматдегидрогеназаL - глутамат + NAD + H2ОСкорость окисления NADH2 в NAD пропорциональна концентрациимочевины в пробе [52, 94].Определение содержания мочевой кислоты проводили энзиматическимколометрическим метод без депротеинизации. Принцип метода [18, 146]:Мочевая кислота + 2H2О + О2уриказааллантоин + CO2+H2O2пероксидазаH2O2+3,5-дихлоро-2-фенолсульфанат+4-аминоантипиринхинонимин+4H2ОУровень креатинина определяли псевдокинетическим методом наоснове реакции Яффе без депротеинизации.
Принцип метода основан на том,что скорость образования окрашенного комплекса креатинина с пикриновой56кислотой в щелочной среде пропорциональна концентрации креатинина впробе [52, 67].Уровень общего и прямого билирубина определяли по диазореакции(методом Йендрассика-Грофа). Принцип метода основан на том, что прямой(связанный, конъюгированный с глюкуроновой кислотой) билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, аобщий билирубин - в присутствии кофеинового реагента с образованиемокрашенного азосоединения. Интенсивность окраски реакционной средыпропорциональна концентрации билирубина [52,67].Методы определения физиолого-биохимических параметровлипидного обменаУровеньобщегохолестеролаопределялиэнзиматическимколориметрическим методом.
Его принцип основан на том, что холестерол изсостава эфиров высвобождается под действием фермента холестеролэстеразы (ХЭ). При участии фермента холестеролоксидазы (ХО) холестеролокисляется до 4-холестен-3-она. Образующаяся перекись водорода, приучастии фермента пероксидазы, способствует окислительному азосочетанию4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола с образованием окрашенногосоединения (хинониминовый краситель).эфиры холестерола + Н2ОХОхолестерол2Н2О2+ 4-ААР + фенолИнтенсивностьХЭхолестерол + жирные кислоты4-холестен-3-он + 2Н2О2пероксидазаокраскихинониминовый краситель + 4 Н20реакционнойсредыпропорциональнасодержанию холестерина в исследуемом материале [38, 124, 167].Количествотриглицеридовопределялиэнзиматическимколориметрическим методом. Он основан на том, что липаза катализируетгидролиз липидов до глицерина и жирных кислот.
Глицерин запускает рядсопряженныхферментативныхреакцийсучастиемферментов57глицерокиназывприсутствииАТФиглицеролфосфатоксидазы.Образующаяся о ходе данных реакций перекись водорода при участиифермента пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4аминоантипирнна и фенола с образованием окрашенного соединения(хинониминовый краситель).липазатриглицеридыглицерин + жирные кислотыглицерокиназаглицерин + АТФглицерол-3-фосфат + АДФглицеролфосфатокидазаглицерол-3-фосфат + О22Н2О2+ 4-ААР + фенолИнтенсивностьдиоксиацетонфосфат + Н2О2пероксидазаокраскихинониминовый краситель + 4 Н20реакционнойсредыпропорциональнасодержанию триглицеридов в исследуемом материале и определяетсяфотометрически [86, 167].Методы определения физиолого-биохимических параметровуглеводного обменаСодержание глюкозыколориметрическимметодв сыворотке определялибездепротеинизацииэнзиматическим(глюкозооксидазныйметодом).
Он основан на том, что β-D-глюкоза под действием ферментаглюкозооксидазы окисляется до D-глюконолактона. Образующаяся в даннойреакции перекись водорода при участии фермента пероксидазы способствуетокислительному азосочетанию 4-аминоантипирина (4-ААР) и фенола собразованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель, краснофиолетовый) (реакция Триндера).β-D-глюкоза + О2 + Н2О2Н2О2+ 4-ААР + фенолглюкозооксидазапероксидазаглюконовая кислота + Н2О2хинониминовый краситель + 4 Н2058Интенсивностьсодержаниюокраскиглюкозывреакционнойисследуемомсредыматериалепропорциональнаиопределяетсяфотометрически [38, 124, 167, 181].Методы определения физиолого-биохимических параметровминерального и водно-электролитного обменовУровень общего кальция в сыворотке определяли унифицированнымколориметрическим методом с о-крезолфталеин комплексоном.
Принципданного метода основан на том, что кальций в щелочной среде образуетокрашенный комплекссо-крезолфталеин комплексоном. Интенсивностьокраски пропорциональна концентрации общего кальция в пробе [39].Количествонеорганическогофосфораопределялиспектрофотометрическим методом. Он основан на способности фосфат-ионовобразовывать в кислой среде с молибдатом аммония в присутствии детергентафосфорномолибдевовыйкомплекс,егооптическаяплотностьпропорциональна концентрации неорганического фосфора в исследуемомобразце [153, 167].Количество магния определяли колориметрическим методом бездепротеинизации. Магний образует окрашенный комплекс с ксилидиловымсиним.
Интенсивность окраски комплекса пропорциональна концентрациимагния в пробе [52, 107].Калий определяли нефелометрическим методом без депротеинизации.Он основан на том, что в результате реакции между ионами калия итетрафенилбората образуется стабильная суспензия. Мутность суспензиипропорциональна концентрации ионов калия [107].Содержание натрия определяли колориметрическим методом. Оноснован на связывании натрия с ионами осаждающего реагента собразованием нерастворимого комплекса.
Оставшиеся в растворе ионыосаждающего реагента образуют окрашенное соединение с тиогликолятом.Интенсивность окраскиреакционной среды обратно пропорциональна59содержаниюнатриявисследуемомматериалеиопределяетсяфотометрически [107].Содержаниехлоридов определяли фотометрическим методом сиспользованием тиоцианата.
Принцип метода основан на том, что хлоридывысвобождают эквивалентное количество тиоцианата из тиоцианата ртути(II). Тиоцианат образует с ионами железа комплекс красного цвета,светопоглощение которого пропорционально концентрации хлоридов [85].Методы определения активности ферментов в сыворотке кровиАктивностьаланинаминотрансферазы(АлАТ)определялиэнзиматическим кинетическим методом (стабилизированные растворы).Под действием фермента АлАТ в результате переаминирования происходитперенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Образующийся в даннойреакции пируват при участии фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) икофермента NАDН2 превращается в лактат.L- аланин + α-кетоглутаратпируват + NАDН + Н+ЛДГАлАТпируват + L-глутаматлактат + NАD+Скорость окисления NАDН2 в ходе второй реакции определяется поуменьшению оптической плотности реакционной среды и пропорциональнаактивности АлАТ [48, 52, 124].Активностьаспартатаминотрансферазы(АсАТ)определялиэнзиматическим кинетическим методом.
Под действием фермента АсАТ врезультате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартатана α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции оксалоацетат приучастии фермента малатдегидрогеназы (МДГ) и кофермента NАDН2превращается в малат.L- аспартат + α-кетоглутаратАсАТоксалоацетат + L-глутамат60МДГоксалоацетат + NАDН + Н+малат + NАD+Скорость окисления NАDН2 в ходе второй реакции определяется поуменьшению оптической плотности реакционной среды и пропорциональнаактивности АсАТ [48, 52, 124].Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови животныхопределяли оптимизированным кинетическим методом. Принцип методаоснован на том, что скорость окисления NADH в NAD+ пропорциональнаактивности ЛДГ [49, 77, 124]:пируват + NADH + Н+АктивностьЛДГлактат + NAD+креатинкиназы(КК)определялиэнзиматическимкинетическим методом:ККФосфокреатин + АДФАТФ + ГлюкозагексокиназаКреатин + АТФАДФ + Глюкозо-6-фосфатГлюкозо-6-фосфатдегидрогеназаГлюкозо-6-фосфат + NADР+6-фосфоглюконат + NADРН + Н+Cкорость восстановления NADР+ в NADРН в пропорциональнаактивности креатинкиназы в пробе [124].Активностьγ-глутамилтрансферазы(ГГТ)всывороткекровиопределяли кинетическим методом.
Принцип метода заключается в том, чтоГГТ катализируетпереносγ-глутамиловой группыс синтетическогосубстрата L-γ-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид на глицилглицин.61Скоростьобразованиявреакции5-амино-2-нитробензоатаопределяется по увеличению оптической плотности реакционной среды ипропорционально активности γ-глутамилтрансферазы [124].Для определения активности щелочной фосфатазы использовалиоптимизированныйкинетическийметодсдиэтаноламиновым(ДЭА)буфером. Его принцип основан на том, что скорость образования пнитрофенола, измеряемая фотометрически, пропорциональна активностифермента [76]:п-нитрофенилфосфат + H2OЩФп-нитрофенол + фосфатАктивность α-амилазы определяли оптимизированным энзиматическимкинетическим методом. Под действием α-амилазы синтетический субстратEPS [4,6-этиледен (G7)–п - нитрофенил – G1 - α, D - мальтогептаозид]гидролизуется с образованием бесцветных нитрофенилмальтозидов.
Поддействиемα-глюкозидазынитрофенилмальтозидыгидролизуютсядоглюкозы и окрашенного п-нитрофенола. Скорость нарастания концентрациип-нитрофенола пропорциональна активности фермента [124].Методика определения динамического поверхностного натяжениясыворотки крови животныхОпределениединамическогоповерхностногонатяжения(ДПН)сыворотки крови проводили на тензиометре ВРА-1Р (Maximum BubblePressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies) (Рисунок 2а). Егопринцип работы основан на методе максимального давления в пузырьке(Рисунок 2б), который является наиболее удобным для исследованиябиологических систем [24, 28, 70, 71, 88, 159].Перед каждым экспериментом вначале проводят измерение ПНдистиллированной воды для контроля чистоты капилляра.
Если капиллярчистый, то тензиограмма для дистилированной воды представляет собойлинию, расположенную параллельно оси абсцисс, то есть значения ПН при62изменении времени существования поверхности изменяются в пределахошибки и находятся в области 72,0-72,3 мН/м (при нормальных условиях).а2а2бРисунок 2 – Тензиометр ВРА-1Р: а) внешний вид б) принцип работыИзмерение проб сыворотки крови проводилось стандартным методом,при котором происходит постепенное увеличение времени существованияповерхности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
