Автореферат (1151291), страница 6
Текст из файла (страница 6)
15,16).30Рисунок 16 -Структурная организация плесневых грибов рода Penicillium,выделенных из спермы, 10µm.В результате изучения криоконсервированной спермы, обсемененнойгрибами, мы выделили аспергиллы и пенициллы, которые хорошо росли на разныхпитательных средах, были неприхотливы и выживали в условиях глубокойзаморозки.Следует подчеркнуть, что подобного рода исследования следует проводить вспециализированноймикологическойлаборатории.Такжецелесообразновыполнять микологическое исследование в условиях технологической цепиполучения спермы (животное-производитель, процессы получения, фасовки ихранения).На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленномпорядкеметодическиерекомендации«Культуральноемикологическое исследование спермы» (№ МЭ 1/0028, от 3 февраля 2017 года).2.4.
Разработка молекулярно-генетических методов идентификациимутаций, ассоциированных с наследственными патологиями крупногорогатогоскота.Быларазработанаистандартизированаметодикадлясвоевременного выявления скрытых дефектов и выбраковывания спермопроб приналичии генетических аномалий. Использовали метод пиросеквенирования,сущность которого заключается в определении нуклеотидной последовательностикоротких фрагментов генов различных мутаций сперматозоидов.Разработанные молекулярно-генетические методы идентификации мутаций,ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями укрупного рогатого скота, позволили выявить в сперме быков-производителей,поступающейвРФиз-зарубежа,такиегенетическиеаномалии,какбрахиспинальный синдром, комплексный порок позвоночника, недостаток адгезии31лейкоцитов, недостаток уридинмонофосфатсинтетазы, цитруллинемию, дефицитфактора свертывания крови XI, дефицит холестерина.С использованием нами разработанной методики при идентификации мутацииSDM результат интерпретировали (рис.
17) на основании наличия нуклеотиднойзамены Сцитозина на T тимин:1) С/С - нормальный генотип - (гомозигота по нормальному аллелю);2) С/T - присутствуют одна мутантная и одна нормальная копии генов(гетерозигота) – животное – носитель мутации SDM;3) Т/Т - мутантный генотип (гомозигота по мутантному аллелю).Рисунок 17 - Пирограммы идентификации мутаций.32При анализе полученных результатов пирограммы сверяли с расчетнымпрофилем (рис. 18), на основании чего получали заключение о генотипе животного.Установлено, что у бурой швицкой породы наиболее часто встречается такая№1№2Рисунок 18 - Результаты амплификации фрагмента гена SPAST BostaurusОбразцы № 1 и № 2 - ДНК, выделенная из спермы различных животных.Животные с нормальным генотипом - гомозигота по нормальному аллелюгенетическая аномалия, как SMA (спинальная мышечная атрофия), у зарубежныхплеменных быков она составила 4,7%, спинальная демиелинизация выявлена у 2%быков.С использованием данной методики в 2017 г в рамках оценки распространениягенетических аномалий у крупного рогатого скота голштинской породы былиполучены данные, представленные в таблицах 5,6.Таблица 5 - Генетические аномалии, обнаруженные у голштинскойпороды крупного рогатого скота.BYБрахиспи-нальныйсиндромCVMКомплекс-ныйпорокпозвоночникавс носи вс носиег тель ег тельоо151 2191 4BLADDUMPSCITНедостат Недостато Цитруллиокк-немииадгезии уридинмолейкоцит нофосфатовсинтетазывс носи вс носи вс носиег тель ег тель ег тельооо213 1203 0218 0FXIDCDHДефицитфакторасвертывания XIДефицитхолестеринавс носиег тельо231 1болен1всегоноситель23810У голштинов наиболее часто обнаруживаются такие генетические аномалии, какдефицит холестерина (4,2%) и комплексный порок позвоночника (2,1%).33Таблица 6 - Генетические аномалии, обнаруженные у бурой швицкой породыкрупного рогатого скота.SDMSMAWBH2SAAСпинальнаяСпинальнаяДегенеративнаяГаплотип 2СиндромДемиелинизациямышечнаямиелоэнцефалопбуройарахномиелииатрофияатияшвицкойвсегоносивсегоносивсегоносивсего носитвсего носиттельтельтельельель15031507150215021500На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Идентификация мутаций,ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиямикрупного рогатого скота голштинской породы, молекулярно-генетическимиметодами» (№ МЭ 1/0029 от 3 февраля 2017 года).2.5.
Разработка алгоритма комплексной диагностики оценки половыхклеток быков-производителей. Анализ доступной литературы и результатысобственных исследований свидетельствует, что назрела острая необходимость вразработке комплексного подхода к оценке генетического материала быковпроизводителейнаоснованииморфофункциональных,генетических,микробиологических и репродуктивных параметров спермы, что может явиться насегодняшний день инновационным биотехнологическим подходом в отечественнойбиотехнике репродукции животных для обеспечения биологической безопасностиРФ и должного контроля распространения всех актуальных моногенныхзаболеваний, которые могут попасть в Российскую Федерации со спермопродукциейдля искусственного осеменения крупного рогатого скота.Предложенный нами алгоритм(рис.19) оценки качества генетическогоматериала включает следующие аналитические параметры: 1) морфологические(морфофункциональные), 2) репродуктивные, 3) генетические (тестирование наналичие генетических аномалий), 3) микробиологические.34Рисунок 19 - Алгоритм оценки качества генетического материалабыков-производителей.2.5.1.
Алгоритм анализа морфологических параметров.Морфологические параметры позволяют установить соотношение междупроцентом нормальных в структурном отношении форм клеток и фертильностью.Последовательность оценки морфологических параметров гамет заключается: а)в выявлении аномальных форм сперматозоидов – дефекты головки, шейки и жгутикасперматозоида. Если аномальных форм сперматозоидов более 18%, такая сперма несоответствует ГОСТу и подлежат выбраковке из племенного ядра.
б) в обнаружениицелостности акросомы сперматозоида (исследование на интактность акросомы).Интактность акросомы (измененный аппарат Гольджи, который содержит ферментыкласса гидролаз для растворения оболочки яйцеклетки при оплодотворении)обеспечивает пенетрацию сперматозоидами оболочек ооцита.
В комплекс оценкиморфофункциональных параметров входит оценка целостности акросомы (в норме35не менее 60% сперматозоидов), посредством усовершенствованного нами способаокрашивания, а также определении индекса фрагментации ДНК (маркер апоптоза),играющего важную роль в регуляции фертильности (с пороговым значением неболее 30%). Для исследования структуры хроматина целесообразно использоватьусовершенствованный нами метод окрашивания ДНК флюрохромом – акридиновыморанжевым. в) исследование репродуктивных параметров половых клеток включаетиспользование органолептических и микроскопических методов для определениявоспроизводительного потенциала спермы быков.Органолептические исследования направлены на оценку внешнего вида,объема и рН эякулята, анализ подвижности и жизнедеятельности гамет (количествоживых и мёртвых спермиев в пробе) и оценку концентрации клеток в объёме.Дифференциацию и идентификацию половых клеток по морфофункциональнымпризнакам важно проводить с учётом данных световой, фазово-контрастной,сканирующейэлектроннойифлюоресцентноймикроскопии;генетическоеисследование гамет на предмет содержания в ДНК аномальных генов брахиспинальный синдром (BY), дефицит холестерина (CDH), дефицит XI факторасвертывания крови (FXID), комплексный порок позвоночника (CVM), дефицитадгезии лейкоцитов (BLAD), дефицит уридин-монофосфатсинтетазы (DUMPS),цитруллинемия (CIT).
При положительном результате хотя бы по одной из данныхпатологий, животное исключают из племенного ядра, а сперму выбраковывают.Микробиологический анализ половых клеток быков-производителей, включаетвыделение из спермы бактерий и грибов, и их идентификацию классическимимикробиологическими методами с помощью применения масс-спектрометрии иАПИ-систем. При наличии патогенных и условно-патогенных микроорганизмовсперму выбраковывают.Предложенный алгоритм комплексного подхода к оценке гамет быковпроизводителей на основании изучения морфофункциональных, генетических,микробиологических и репродуктивных параметров спермы с использованиемновых и усовершенствованных нами методов оценки её качества, позволитпредотвратить ввоз на территорию РФ и применение для искусственногоосеменения некачественного генетического материала крупного рогатого скота иобеспечить биологическую и продовольственную безопасность нашей страны.363.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ1. Разработан комплексный методологический подход к оценке качества спермыбыков-производителей, включающий анализ морфофункционального состояниягамет(наличиеихфрагментированнойаномальныхимитохондриальнойфрагментированныхДНК),форм,репродуктивныхчехлика,параметров(внешний вид, объем, pH, подвижность, количество живых и мертвых клеток, ихконцентрация), генетических дефектов: брахиспинального синдрома, комплексногопорока позвоночника, недостатка адгезии лейкоцитов, уридинмонофосфатсинтеазы,цитруллинемии, дефицита фактора свертывания крови, холестерина, а такжемикробиологических характеристик (наличие/отсутствие общего микробного числанепатогенныхмикроорганизмов,бактерийизгруппыкишечнойпалочки,псевдомонад, кокков, микоплазм, кампилобактерий и грибов).2.Модифицированныйэкспресс-методидентификациианомальныхформсперматозоидов позволил выявить в половых клетках, разделенных по полу,следующие патологические формы: отделившаяся головка - 23%, аномальнаяголовка – 32 %, согнутые хвосты – 36%, закрученные хвосты – 33 %.3.
Разработанный экспресс – метод морфофункциональной дифференциацииполовых клеток с помощью селективного окрашивания тест-набором Дифф-Квикпозволил получить объективные данные об их структурном и функциональномсостоянии. Сперматозоиды с поврежденной акросомой изменяют тинкториальныесвойства и приобретают светло-розовый цвет, неповрежденные имеют коричневыйоттенок. При исследовании сексированного семени от 20 быков, у 19 животныхсредний показатель количества сперматозоидов с интактной акросомой составил78%.4. Выявлен механизм фрагментации ДНК в головке и шеечной частисперматозоидов, определены пороговые (до 30%) значения индекса фрагментациинуклеиновых кислот, отклонения от которых свидетельствуют о митохондриальнойдисфункции, вызывающей астеноспермию. При исследовании проб сексированнойспермы от 20 быков-производителей, завезенных из США, с использованиемразработанного нами метода у 20 % быков обнаружен индекс фрагментации ДНК31,2%,у30%митохондриальнаябыковДНКв–сперматозоидахсвечение37обнаруженахвостовойчастифрагментированная(митохондриальнаядисфункция).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
