Автореферат (1151291), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Средние значения и стандартные ошибкиподсчитывались в программе Excel, входящей в программное обеспечениеMicrosoftOffice 2007. Цифровой материал был подвергнут статистической обработкепо методике Яковенко А.М. «Биометрические методы анализа качественных иколичественных признаков в зоотехнии» (2013).Основные результаты проведенных исследований были доложены:На международных конгрессах: 4th EAVLD Congress of the European Associationof Veterinary laboratory Diagnosticians (Чехия, Прага, 2016).Намеждународныхконференцияконференциях:«Приоритетымеждународнаяветеринарнойнаукиинаучно-практическаяинновационныйопыт»(Республика Азербайджан, Баку, 2016); IV международная научная конференция«Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященная 55-летиюучреждения аспирантуры для подготовки научных работников в ФГБУ «ВНИИЗЖ»(Владимир, 2016); международная научно-практическая конференция «Проблемы иперспективы развития современной репродуктивной технологии, криобиологии и ихроль в интенсификации животноводства» (Московская обл., пос.
Дубровицы, 2017);международная научно-практическая конференция «Перспективы и актуальныепроблемы развития высокопродуктивного молочного и мясного скотоводства»(Республика Беларусь, Витебск, 2017); международная научно-практическаяконференция «Генетический материал – стратегический запас страны. Требования кпроведению контроля качества генетического материала» (ОАО «Головной центр повоспроизводству сельскохозяйственных животных», Московская обл., Быково,2017), на 14-ой международной выставке «Молочная и мясная индустрия» (Москва,2016).Нанаучно-практическихконференциях:10практическоеиспользованиесовременных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатогоскота (Московская обл., Быково, ОАО «ГЦВ», 2011); племенные ресурсы ОАО«Московское» по племенной работе и их использование в совершенствовании скотаРФ (Московская обл., Ногинск, 2017); племенная база животноводства России:стратегия развития, (Московская обл., Быково, 2018).
На Всероссийском совещании«Итоги племенной работы за 2016 год и задачи на 2017 год», (Волгоград, 2017). Насеминарах: по оценке качества семени, организованный IMV Technologies (Франция,г. Лэгль, 2017); требования и процедуры контроля пищевой безопасности вЛатинской Америке при экспорте в Эквадор (Эквадор, 2017); современноеплеменное молочное животноводство Московского региона и перспективы егоразвития» (Московская обл., Ногинск, 2017). На круглых столах: приоритетныенаправления законодательного обеспечения развития молочного животноводства до2020 года (Москва, Комитет Государственной Думы по аграрным вопросам, 2016);проведение комиссионного эпизоотического обследования племенных хозяйствПриозерского и Лужского районов Ленинградской области, закупающих импортныйплеменной материал (Санкт-Петербург, 2018).Личный вклад соискателя.
В представленных материалах автору принадлежитвыбор научной проблемы, определение цели, постановка задач, выполнениерасчетовипроведениеморфологических,биофизических,биохимических,генетических, микробиологических исследований, научно-техническое руководствопроведения всех экспериментов, верификация иметрологическая экспертизаавторских методов; моделирование и интерпретация полученных результатов,обоснование и формулирование выводов, а также статистическая обработкаполученныхрезультатов.Результатытеоретическихиэкспериментальныхисследований получены автором лично или при его определяющим участии, всовместных работах с д.б.н.
Б.С. Иолчиевым, доцентом В.Э. Новиковым, к.х.н. Е.Е.Давыдовой, к.б.н. С.П. Яцентюк.Публикации. По теме диссертации опубликовано 38 научных и учебнометодических работ, в том числе 24 научные статьи, из них 14 научных статей визданиях,рекомендованныхВысшейаттестационнойкомиссией(ВАК)Министерства образования и науки Российской Федерации, 1 патент, 1 ГОСТ, 1учебник, 2 учебно-методических пособия, 2 методических указания и 711методических рекомендаций, утвержденных РАН.Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 379страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзорлитературы, собственные исследования, включающие материалы и методы,результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, сведения опрактическом исследовании научных результатов, рекомендации по использованиюнаучных результатов, список использованной литературы (495 источников, в томчисле 333 отечественных и 162 зарубежных).
Работа содержит 30 таблиц, 82рисунка, 54 страницы приложений.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫВ первом разделе (Глава 1) представлен аналитический обзор литературы,содержащий данные о системе международного обмена спермопродукции, еёморфологической и молекулярно-биологической характеристике, рассмотренывопросы повышения качества половых клеток, ветеринарно-санитарного контролязамороженной спермы, описаны механизмы влияния условно-патогенных бактерийи грибов-контаминантов на половые клетки, генетические мутации крупногорогатого скота, передающиеся при искусственном осеменении, их роль ввозникновенииврождённыханомалий,атакжехарактеристикавоспроизводительной активности сексированного семени на территории России.2.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Материалы и методы исследования. Работа выполнена на базе кафедрымикробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И.Скрябина.Экспериментыоплодотворяющейпоисследованиюспособностииморфологическихгенетическогохарактеристик,профиля,молекулярно-генетические исследования спермы крупного рогатого скотах, поступающей из-зарубежа и отечественного производства, были проведены в отделении биотехнологииФГБУ «ВГНКИ», а также в институте химической физики им. Р.Н. Семенова РАН ив ведущих племенных центрах РФ - ОАО ГЦВ и ОАО «Московское».Материаломдляисследованийслужиласпермопродукциябыков-производителей: разделенная по полу, свежеполученная неразбавленная, свежеполученная разбавленная синтетическими средами, замороженная сперма от такихпород крупного рогатого скота, как голштинская, бельгийская бело-голубая и бурая12швицкая.Всего было исследовано 1352 спермопробы, из них 100 проб сексированнойспермы, 325 проб свежеполученной и 1027 проб криоконсервированной спермы.
Изотечественных племобъединений было исследовано 668 проб спермы, завезенной вРФ из-за рубежа – 684.Для определения морфофункциональных параметров половых клеток быковпроизводителей были разработаны и модифицированы экспресс-методы поопределению целостности их акросомы, структуры ДНК-хроматина, а такжеприменяли окрашивания спермы для оценки морфологических особенностейсперматозоидов при идентификации аномальных форм половой клетки, чтопозволяло проводить детальную цитоморфометрию.Для культивирования выделенных из спермы бактерий и грибов и определенияих биологических свойств использовали следующие основы питательных сред идобавки: основа бульона для Mycoplasma - основа бульона PPLO BBL; дрожжевойэкстракт Bacto; агар бактериологический Bacto («Becton, DickinsonandCompany,США); сыворотка крови лошадиная стерильная для культивирования микоплазм(«Биолот», Россия);галерея API (среды для приготовления суспензий, реактивы дляпроявления реакций, минеральное масло, тест на каталазу, тест на оксидазу, списокчисловых профилей и программное обеспечение APIWEB).Примикробиологических,молекулярно-генетическихимолекулярно-биологических исследованиях спермы методом ПЦР применяли коммерческие тестсистемы и реагенты отечественного и зарубежного производства (LSI VetMAXCfmpilobacter spp., LSI VetMAX Mycoplasma bovis, Тест-система «МИК-КОМ»,Тест-система «КАМ-БАК»).Для проведения исследований по действию лазерного УФ-излучения наморфологические показатели и биологические свойства спермы с цельюмоделирования негативного воздействия на сперму, разделенную по полу, былииспользованы сконструированные совместно с кандидатом биологических наук,доцентом кафедры радиобиологии и вирусологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВАимени К.И.
Скрябина Новиковым В.И. 4 лабораторные модели лазерных излучателя,в том числе 2 «когерентных» излучателя с длиной волны 405 нм (излучатели далееобозначены как И-1 (5 мВт) и И-2 (10 мВт), а также 2 «некогерентных», оба с13длинами волн 405 и 465 нм, различающиеся по мощности (далее обозначены как И3 и И-4).Анализ качества спермы после облучения проводили по стандартнымметодикам на автоматических спермоанализаторах «AndroVision» и «Biola-AFS500». В качестве показателей оценивали изменение следующих величин: % общейподвижности (ОПД), % прямолинейно поступательной подвижности (ППД), %быстрых клеток, общую (среднюю) скорость движения мкм/с, % неподвижныхклеток (НПД).Морфологические исследования выделенных микроорганизмов проводили спомощью электронной модуляционной интерференционной микроскопии насканирующем электронном микроскопе Vega II LMN.
Схема эксперимента указанана рисунке (рис.1).Рисунок 1 - Схема эксперимента.2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХОБСУЖДЕНИЕ2.2.1 Морфологическая оценка аномальных форм половых клетокбыков-производителей. Образцы спермы быков-производителей, как известно,содержат сперматозоиды с различными типами нарушений.
Дефекты в процессесперматогенеза, некоторые бактериальные инфекции, а также различные формыпатологии в репродуктивной системе быков-производителей чаще всего связаны сувеличенным количеством аномальных форм сперматозоидов.Вместе с тем, метод выявления в сексированной сперме аномальных форм14половых клеток требует объективизацииПри идентификации морфологических дефектов нами была выявленасочетанность их проявления. Как известно, аномальный сперматозоид обычно имеетсниженный оплодотворяющий потенциал, зависящий от типа аномалии, и можетсодержать также аномальную ДНК. Согласно полученных нами экспериментальныхданных, был подтвержден тот факт, что морфологические дефекты связаны сусиленной фрагментацией ДНК, повышенным риском структурных хромосомныхаберраций, наличием незрелого хроматина.
Именно поэтому нами проведеноисследование по выявлению морфологических особенностей сперматозоидов дляоценки формы их головки и жгутика.Для оценки морфологических особенностей сперматозоидов нами былапробирован экспресс-метод их окрашивания с целью идентификации аномальныхформ с использованием комплекса красителей Farelly Stain, предназначенного длябыстрого окрашивания тканей в образце в процессе их микроскопическогоисследования.Использованный нами ускоренный метод окрашивания при помощи красителяFarelly (Minitube) позволил тинкториально выявлять головку, шейку, хвост иоптимизировать условия идентификации и дифференциации патологических формсперматозоидов (способ пробоподготовки, время окрашивания, параметры оценкирезультата) (таблица 1).Таблица 1 - Результаты морфологической оценки сперматозоидовКол-воПатологические формы, %быков -Исследованопроизво-спермопробдителей2040Отделившаяся Аномальная Согнутые Закрученныеголовкаголовкахвостыхвосты23323633Установлено, что во всех исследуемых образцах спермы, разделенной по15полу, производства Великобритания, присутствовали патологические формысперматозоидов в высоком % случаев (от 23 до 33%), что превышало содержаниеаномальных форм значений нормы по ГОСТ, где указано, что количествосперматозоидов с аномальным строением не должно превышать 18%.2.2.2 Оценка целостности акросомы половых клетокВыявление в эякуляте повышенного содержания сперматозоидов с аномальнойакросомой – одна из причин идиопатического бесплодия сельскохозяйственныхпроизводителей, даже при нормативных параметрах спермограммы (БрагинаЕ.Е.,1997, Курило Л.Ф., 1998, Carrell et at.,1999, Гришина Е.М.,2004) Это связано стем,чтосперматозоидысагенезомакросомыизменяютпроницаемостьплазматической мембраны для ионов Са, теряют способность прикрепляться кмембране ооцита.Для оценки биологического профиля состояния акросомы сперматозоида внастоящее время используют ряд методик по ее окрашиванию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
