Автореферат (1151291), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Методика, указаннаяв ГОСТ № 32277 – 2013, а именно пункт 8.4, по нашему мнению, не отвечаетсовременным требованиям определения целостности акросомы сперматозоида.Указанный в ГОСТе краситель эозин/нигрозин целесообразно использовать дляопределенияколичествамертвыхиживыхсперматозоидов,нонедлядифференциации морфофункциональных характеристик изучаемых половыхклеток.Нами были отработаны этапы и условия пробоподготовки, время окрашиванияполовых клеток и параметры оценки результатов (предложена форма расчетаколичества сперматозоидов с поврежденной акросомой в %).Было показано, что сперматозоиды крупного рогатого скота с поврежденнойакросомой изменяют свои тинкториальные свойства под воздействием красителяДифф-Квик и приобретают светло-розовый цвет (рис.
2 в, г), в то время как в нормеони имеют коричневый оттенок (рис.2 а, б).16бавгРисунок 2 - Микроморфологические особенности сперматозоидов:(а, б) сперматозоид с целойакросомой; (в, г) сперматозоид с поврежденнойакросомой.Ув.: а,г – (х400); б,в –(х100)Нами было исследовано 30 спермопроб быков-производителей в трехкратнойповторности на определение целостности акросомы сперматозоидов. Среднийпоказатель количества сперматозоидов с интактной акросомой составил 87%, чтонаходится в пределах нормы (не менее 60%) по ГОСТ № 32277 – 2013.При исследовании проб спермы, разделенной по полу, от 20 быков былопоказано, что во всех исследуемых образцах средний показатель количествасперматозоидов с интактной акросомой составил у 19 животных 78%, а у одногобыка HuijbenDGBuick содержание целостной акросомы было менее 50 %, что несоответствует нормам ГОСТ Р 54633-2011.Предлагаемая нами методика с использованием тест - набора Дифф-Квик позволяетполучать результаты с высокой степенью достоверности и является болееэффективной по сравнению с другими методами окрашивания акросомысперматозоида животных-производителей.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Определение целостностиакросомы сперматозоидов в замороженной сперме у животных-производителей» (№МЭ 1/0021, от 16 октября 2017 года).2.2.3 Разработка методики подсчета индекса фрагментации ДНКхроматина сперматозоида.
Фрагментация ДНК сперматозоидов – относительнонедавнооткрытаяпричина бесплодия. Она включаетдвухцепочечные иодноцепочечные разрывы молекулы ДНК.В норме хроматин зрелых сперматозоидов плотно упакован, чтобы защититьДНК от потенциальных повреждающих воздействий во время транзита по половымпутям самца и самки. Высокая плотность упаковки хроматина достигается за счет17замены белков-гистонов, характерных для всех соматических клеток организма, наспециальные переходные белки и протамины.Митохондриальная дисфункция – это обширная группа патологическихсостояний,обусловленныхгенетическими,структурными,биохимическимидефектами митохондрий, приводящих к нарушению синтеза АТФ и гиперпродукцииАФК (рис. 3).Выделяют два параметра митохондриальных дисфункций: первичную –врожденный генетический дефект и вторичную - под действием различныхфакторов: окислительного стресса, облучения и т.д.
(Клембовский А.И., 1999; ВасюкЮ.А., 2003; Угольник Т.С., 2012; Кидун К.А., 2013; Удалов Ю.Д. с соавт., 2017).При исследовании проб спермы, разделенной по полу, от 20 быковпроизводителей выявлено 4 быка с повышенным индексом фрагментации ДНК(более 30 % в головке сперматозоида) и 6 быков с фрагментированной мт-ДНК(зафиксировано свечение хвостовой части, то есть установлена и митохондриальнаядисфункция сперматозоидов).вбаРисунок 3 - Фрагментация ДНК сперматозоида. Ув.:(х100)а) фрагментация ДНК сперматозоида в области головки на фоне неповрежденныхполовых клеток; б) фрагментация ДНК сперматозоида как в головке, так и вхвостовой части; в)фрагментация ДНК сперматозоида в области шеечной частимитохондриальная дисфункция.Все исследованные пробы спермы, разделенной по полу, не соответствовалиГОСТР54633-2011,посколькучислосперматозоидовспрямолинейно-поступательным движением составляло менее 40 %.Таким образом, наши исследования подтвердили факт снижения подвижностисперматозоидов, а именно явление астеноспермии у всех гамет, а также установилипричину данного явления.Наоснованиипроведенныхисследованийразработаныиутвержденывустановленном порядке методические рекомендации «Определение индекса18фрагментации ДНК в замороженной сперме у животных-производителей (№ МЭ1/0020, от 20 октября 2017 года)».2.2.4 Оценка качества облученной спермы по морфологическим показателям.В настоящее время в ряде технологических процессов, связанных с подготовкойсеменного материала к разделению по полу, с последующей криоконсервацией,используют процедуру, включающую воздействие на гаметы излучения лазера вУФ-области (365-405нм).
При этом также применяют некоторые красители, так илииначе обладающие фотосенсибилизирующим действием. О допустимости такоговоздействия с точки зрения нежелательных экономических или генетическихпоследствий в литературе имеются разрозненные и противоречивые сведенияавторов (Костамахин Н.М., 2005; Жебровский Л.С., 2002; Жигачев А.И. 2008; ЕскинГ.В., 2010).Специальных полномасштабных исследований влияния лазерного УФизлучения на фертильность спермы не проводили.Нами было изучено действие УФ на сперматозоиды крупного рогатого скота, взависимости от дозы, длины волны, мощности и т.п. В качестве критериев оценкивоздействия,помимообщепринятыхвживотноводстве(восновном,морфофизиологических и цитохимических – микроскопическое исследованиеподвижности ибиофизическиежизнеспособности), нами разработаны биохимические икритерии,характеризующиеэнергетическуюфункциюмитохондрий, активность ферментов акросомы, устойчивость показателей кснижению рН и т.п.
Созданные лабораторные модели лазерных излучателей: И1(конструкция излучателя со стационарной кюветой), И-2(конструкция излучателяс проточной кюветой-капилляром), излучатель И-3 - (осветитель ОИ-28 сгалогеновой лампой КГМ-7, обеспечивающий сплошной спектр в диапазоне 3001000нм, с комплектом из двух сменных интерференционных светофильтров 365 нми 405нм) и излучатель И-4 - (ртутная лампа сверхвысокого давления «ДРТ-120» - какисточник линейного спектра, с длиной волны 465 нм), а также разработанныережимы облучения спермы, позволили изучить и установить негативное действиеУФ облучения (доза, длина волны, мощность) на концентрацию клеток, ППД в %,% быстрых клеток, скорость движения.19Рисунок 4 - Динамика общей подвижности сперматозоидов после облучения.Полученные результаты позволили оценить уровень общей подвижностиспермиев в процессе инкубации после размораживания и облучения клеток как встационарном, так и в проточном режиме, где четко вырисовывалась картина кснижению показателя подвижности в среднем от 10 до 40% после разморозки иоблучения, а также зафиксирован процент снижения быстрых клеток (в среднемкаждый час ППД падала на 14%); процент подвижности клеток, общая скоростьдвижения (рис.
4,5).Рисунок 5 - Динамика % «быстрых» клеток в процессе инкубации послеоблучения.Лазерное излучение усиливает негативное воздействие на все изучаемыепараметры и приводит к снижению жизненноважных показателей половых клетокбыков-производителей даже при очень кратковременном (от 0,02 до 0,07 сек.)воздействии, где средняя скорость снижается после облучения в семь раз.20Губительное действие при этом проявляется одинаково независимо от режимаоблученияиотисходногокриоконервированная).Былосостоянияспермыустановлено,что(свежеполученнаяфлюрохромилиобладаетфотосенсибилизирующим эффектом и выступает в качестве мощного окислителя,разрывая своим токсическим действием нити ДНК, что приводит к патоспермии, а вдальнейшем к апоптозу половых клеток.Рисунок 6 - Изменения относительно контроля параметров сперматозоидовнепосредственно после воздействия излучения.Полученные результаты исследований действия УФ-излучения на характердвиженияиподвижностьсперматозоидовбыков-производителейбылиследующими: при облучении в проточном режиме фотосенсибилизирующий эффектпроявлялся в снижении подвижности клеток до 40 % в сравнении с контрольнымиобразцами, а после 4 ч.
инкубации в термостате при t=38 °С их подвижностьснижалась до 23 %;под воздействием УФ сперматозоиды приобретали активновозбужденное состояние,характеризующееся хаотичным движением, котороесменялось угнетением подвижности, что приводило к гибели половых клеток, атакже, к появлению сперматозоидовс закрученными хвостами иизмененным вектором движения (рис.6).21клеток с2.3. Изучение контаминации спермы крупного рогатого скота отечественного изарубежного производства возбудителями бактериальных инфекций.
Половыеклетки в обязательном порядке исследуют на ряд инфекционных и специфическихпатологий. Перечень инфекционных агентов постоянно актуализируют с учетомпотенциальных рисков распространения болезней, большое внимание уделяют приэтом биологическим параметрам качества спермы. Тестированию «золотымстандартом» на: P. aeruginosa, E. coli, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,Mycoplasma spp., Campilobacter spp. мы подвергали образцы спермопроб,положительно отреагировавшие по результатам ПЦР исследований.Таблица 2 – Результаты микробиологических исследованийспермопробВид инфекцииКоличествоБактериологический посевисследованныхобразцовСексированная Зарубежная ОтечественнаяКокковаяинфекция23200P.
aeruginosa23203Единич.колонии впределахГОСТ3E. coliMycoplasmaspp.Campilobacterspp.2322290003606222205422При исследовании 222 образцов спермодоз методом бактериологических посевовбыл зафиксирован рост Campilobacter spp. в 14,8% образцах, в 62 образцах спермыиз отечественных племцентров и 36 образцах спермы из зарубежных хозяйстввыявлен рост микроорганизмов рода Mycoplasma spp., что составляет 42,7% от ихобщего количества; 232 образца спермы 2,6% были контаминированы P.aeruginosa.Результаты представлены в таблице 2.2.3.1 Контаминация спермы быков-производителей бактериями родаМycoplasma.Материаломслужили246образцовкриоконсервированнойспермопродукции быков-производителей коммерчески значимых пород мясного имолочного направления, из них 120 проб отечественного происхождения и 126 –зарубежного производства.Длякультивированиямикоплазмиспользовалиспециальныедифференциальные микробиологические агаровые питательные среды: PPLOбульон с ростовыми добавками с кристаллическим фиолетовым и PPLO агар фирмыHimedia (Индия).выделенияПри подборе питательной среды для культивирования имикоплазмвобразцахспермыбылииспользованысредыPPLOBrothBasew/CVV268.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
