Автореферат (1151291), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Среда М268 с добавлением лошадиной сыворотки в 20%случаев не позволила получать/выделить микоплазму. Среда М268 с добавлениемдобавки FD0075, которая содержала лошадиную сыворотку, дрожжевой экстракт,бензилпеницилин и талия ацетат явилась пригодной для выделения микоплазм вобразцах спермопроб.
Микроскопическое исследование выделенных микоплазмпроводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Vega II LMN.Таблица 3 - Результаты выделения Mycoplasma spp. из спермы(2017 – 2018 гг.)Страна-поставщикКоличествоспермодозРоссияСШАКанадаВеликобритания103424242Метод выделения и процентноесоотношение микоплазмБак.посев%6260,11740,41228,5716,6Из подвергнувшихся исследованию 229 образцов наибольшее количествообсемененных (60,1%) было выявлено в сперме быков отечественного производства.23Результаты тестирования образцов бактериологическим методом подтвердили ростмикоплазм в 98 образцах (таблица 3).Рисунок 7 - Рост Mycoplasma spp., выделенной из спермы, в полужидкихобогащенных средах.Установлено, что в полужидких обогащённых ростовыми добавкамипитательных средах микоплазмы растут по уколу, образуя крошковатые колонииразличной конфигурации, равномерно распределенные по внутренней частипространства в виде светящихся комет (рис.
7).На плотных питательных средах микоплазмы формируют характерныеколонии, напоминающие по форме яичницу - глазунью (рис.8).Рисунок 8 –Колонии Mycoplasma spp. на плотной питательной среде по результатамфазово-контрастной микроскопии. х200 (под иммерсионным маслом).Структурная организация культуры Mucoplasma spp. представлена на рис.9.Рисунок 9 - Сканограмма культуры Mycoplasma spp. х20 мкм.24Исследованием в сканирующем электронном микроскопе фрагментов колониймикоплазм, выращенных на поверхности мембранных фильтров, установлено, чтопопуляция представлена плотно упакованным в виде бугорков кластером,погруженным в межклеточный матрикс.Сравнительный анализ эффективности метода ПЦР и бактериологического методапри выделении из спермы микоплазм, позволил нам разработать алгоритмисследования спермопроб быков-производителей на микоплазмоз (рис.10).Рисунок 10 - Алгоритм исследования спермы на микоплазмоз.Предложенная схема проведения лабораторного контроля спермопродукции намикоплазмоз, включает: первичное тестирование спермодоз методом ПЦР;культивирование положительных образцов на дифференциальных питательныхсредах; окончательное тестирование культур с подтвержденным ростом методомПЦР.Разработанный алгоритм исследования спермопроб быков-производителей намикоплазмоз является современным методологическим подходом к диагностикеданногозаболеваниякрупногорогатогоскота.Онимеетважноепротивоэпизоотическое значение, так как способствует разработке эффективныхмероприятий по профилактике и борьбе с болезнями животных, вызываемыхмикоплазменными микроорганизмами.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Ветеринарно-сани-тарныйконтролькачествамикробиологическогозамороженнойанализаспермыбыков-производителей.замороженно-оттаяннойпроизводителей» (МУ от 21.12.2018 г).25спермыМетодыбыков-2.3.2 Мониторинг выявляемости бактерий рода Campilobacter из спермы,поступающей в РФ из-за рубежа.
Материалом для исследований служили 222образцакриоконсервированнойспермопродукциибыков-производителейкоммерчески значимых пород мясного и молочного направления, из них 103 пробыотечественного и 119 – зарубежного производства.Длякультивированиякампилобактерийиспользовалиспециальныедифференциальные микробиологические агаровые питательные среды: бульонБолтена и среду Престон фирмы Himedia (Индия).Идентификацию микроорганизмов рода Campylobacter проводили такжереференсным методом с использованием галереи стрипов API системы (Франция) сприлагаемыми к ним средами-суспензиями и реактивами для учета реакции(«Золотой стандарт»). Интерпретацию полученных результатов осуществляли приподдержке программного обеспечения APIWEB (Франция).Результатыидентификациикампилобактерийсравнивалисданными,полученными с помощью масс-спектрометра MALDI BRUCER.Микроскопическое исследование выделенных кампилобактерий выполняли спомощью электронной модуляционной интерференционной микроскопии насканирующем электронном микроскопе Vega II LMN.Таблица 4 - Результаты выделения кампилобактерий из спермыСтрана-поставщикспермодозКоличествоспермодозCampylobacter spp.C.
fetusC. JejuniБак.посевБак.посевБак.посевРоссия10318 (17,4%)06 (5,8%)США307 (23,3%)013 (43,3%)США29 (сексированная)000Канада303 (10%)09 (30%)Великобритания305 (16,6%)010(33,3%)При исследовании образцов спермы бактериологическим методом «Золотойстандарт» с использованием галереи стрипов API и сличительными даннымибиблиотеки микроорганизмов масс-спектрометра MALDI BRUCER, в 6 образцах из26103 проб отечественного семени была обнаружена C. Jejuni, что составило 5,8% отобщего количества проб. Из 119 проб зарубежной спермы C.
Jejuni была обнаруженав 32 образцах, что составило 27,0% (таблица 4.).Таким образом, сперма, поступающая в РФ из-за рубежа, обсемененапатогенными кампилобактерами на 21,2% больше, чем отечественная.Нами усовершенствован алгоритм диагностического исследования спермопроббыков-производителей на кампилобактериоз, который включал следующие этапы:1. Приготовление мазков из спермы, их окрашивание, микроскопия дляпервичного обнаружения кампилобактерий и установления их морфологическиххарактеристик.2. Посев изучаемого биоматериала на специальные питательные среды дляоценки культуральных свойств выделенных микроорганизмов с целью первичнойидентификации кампилобактерий.3. Идентификация кампилобактерий до вида бактериологическим методом«Золотой стандарт» референсным методом с использованием галереи стрипов APIсистемы, с прилагаемыми к ним средами-суспензиями и реактивами для учетареакции при поддержке программного обеспечения.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Методы исследованийфизических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качествакриоконсервированной спермы производителей» (№ МЭ 1/0024, от 23 октября 2017года).2.3.3 Определение уровня обсемененности спермы микромицетами.Согласно ГОСТ 32198-2013, исследование спермы на наличие грибов проводятвысевом на мясопептонный агар, не предназначенный для выявления грибов,приспособленных к развитию в условиях низких температур, и дифференциациейвыявляемых грибов.Намипроведенымикологическиеисследованияиспользованием современных дифференциальных сред.20пробспермысБыли апробированыселективные добавки, проведено испытание рабочих характеристик питательныхсред для выявления разных видов грибов, подобраны условия инокуляции икультивирования.27Метод заключается в посеве подготовленного образца спермы на наборпитательных сред (Сабуро с глюкозой, картофельно-глюкозный агар, среда сдихлораномибенгальскимрозовым(DRBC),хромогеннаясредадлядифференциации грибов рода Candida) с дальнейшим культивированием грибов иих идентификацией.Результат считали положительным, если, как минимум, на двух чашках изодного разведения обнаруживался рост аналогичных грибов, при этом вконтрольных чашках роста грибов не наблюдали.С целью изучения уровня обсемененности спермы быков-производителейплесневыми и дрожжеподобными грибами проводили разведение образца спермыстерильным пептонно-солевым раствором, а последующие разведения готовилианалогично, используя для приготовления каждого разведения новую стерильнуюпипетку.
Кратность разведения определяли, исходя из ожидаемого уровняконтаминации спермы грибами таким образом, чтобы на инокулированных чашкахПетри вырастали изолированные колонии микромицетов.Результат считали положительным, если хотя бы на одной из чашек,независимо от разведения, обнаруживали рост грибов, все чашки с контрольнымисредами были чистые. В случае получения положительного результата исследованиепроводили повторно, используя двукратное количество образца и двукратноеколичество питательных сред.Было исследовано 16 проб спермы в соответствии с МР «Культуральноемикологическое исследование спермы» (рис. 11,12).ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойПоложительныеОтрицательныеРисунок 11 - Количество проб спермы с положительными отрицательным результатом исследования на плесневые грибы.Рост грибов наблюдали в 7 образцах из 16, что составило 43,75%.28Видовой состав выделенных грибов был следующим:- в 4 образцах обнаружен Aspergillus niger (57,14%);- в 1 образце – Aspergillus flavus (14,29%);- в 3 образцах - грибы семейства Mucoraceae (42,86%).Кроме того, в двух образцах обнаружено 2 вида грибов – Aspergillus niger иMucor spp.
(28,57%).ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойAspergillus nigerAspergillus flavusf. MucoraceaeAspergillusniger+Mucor spp.Рисунок 12 - Видовой состав грибов, выделенных из спермы.Рисунок 13 - Сканоэлектроннограмма А. niger, выделенного из спермыбыка-производителя, 20µm.Изучение ультраструктурной организации гриба показало наличие у негоскрученной головки, спороносных структур с конидиями, расположенных поверхслоя компактного белого или светло-желтого субстратного мицелия (рис.13).
Гифымицелия извилистые, плотно контактируют между собой, не имеют четкойупорядоченности, их верхушки веерообразно расходятся. Подобного родаархитектоника может обеспечивать плотный контакт апикальных структур гифов.Установленная микрокартина свидетельствует о фазе роста исследуемого гриба.29Рисунок 14 -Особенности структурной организации A. niger.Сканирующая электронная микроскопия, 10µm.На конидиеносце выявлены стеригмы (метулы и фиалиды) зернистой иморщинистой формы.
Зачатки метул характеризуются синхронным апикальнымростом и высокой композиционной плотностью. Апикальный рост индуцируетформирование в период кондиогенеза зрелых конидиальных головок (рис. 14).Рисунок 15 -Ультраструктурная организация A. flavus, выделенногоиз спермы СЭМ-изображение, 2 µm.Конидиальные головки A. flavus имеют типичную радиальную ориентацию,они наделены, как правило, двухъярусными конидиогенными структурами иметулами, покрывающими всю поверхность вздутия, образующие их гифоподобныеклетки относительно толстостенные (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
