Автореферат (1150765), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Это можетбыть вызвано наличием на шероховатой поверхности рассеивающих центров, которые участвуют как в процессе рассеяния молекулами Р6Ж, так и в процессе их флуоресценции. Пространственное ограничение, существующее ввиду наличия на поверхности пор, приводит кобразованию молекулярного комплекса.Детектирование интенсивности флуоресценции молекул Р6Ж в пленке ПВС показало,что сдвиг частот максимума испускании флуоресценции в красную область, обусловленногогенерацией поверхностных плазмонов в НЧ серебра происходит незначительно, однако приэтом достаточно уверенно детектируется синий сдвиг частот стоксовых колебаний КРС НЧсеребра.
Можно предположить, что интенсивность спектров КРС Р6Ж в пленке ПВС вблизиповерхности обусловлено установлением взаимодействия между цепями полимеров и красителем на уровне частот колебаний групп СО- и ОН-.В результате исследований было установлено, что модифицированные шероховатыестекла позволяют усилить поверхностными плазмонами НЧ серебра КРС на молекулах Р6Ж(до порядков 104).
Перенос энергии в системе НЧ-краситель может быть описан в рамках модели Фёрстера. Эффективность переноса оценивалась по формуле:E = 1−I flI fl 0=R06τ= 1 − DA66τDR0 + r(2)Эффективный радиус переноса был рассчитан в соответствии:1 k 2ϕ ∞6R0 = 0,2108 4 ∫ I D (λ )ξ A (λ )λ4 dλ n 0(3)Было установлено, что константа скорости dd- переноса достигает порядка k dd =5,7·107 c-1, а эффективный радиус переноса и расстояние между молекулой красителя и НЧсоставляет R 0 = 5,41 нм и r = 6,52 нм соответственно. Однако детектируемые КР спектральные пики спектров Р6Ж (табл.
1) имеют выраженные сдвиги в синюю и красную область относительно литературных данных [14] и библиотеки KnowItAll Academic Edition (BioRad),что не позволяет обеспечить необходимую степень повторяемости для анализа сложныхбиомолекул - белков, исследуемых в данной работе.10Табл. 1Экспериментальные и теоретические данные детекции максимумов Р6Ж№ п/пСостав структурыР6Ж+ПВС на стекле+ НЧ Ag1Р6Ж+ПВС+Ag2ν h, exp , см-1ν h, теор (лит) , см-1222, 349, 602, 770,300, 375, 518, 604,1180, 1349, 1370,1172, 1356, 1504,1507, 16441571, 1647380, 612, 770, 1191,1370, 1518, 1664300, 375, 518, 604,1172, 1356, 1504,1571, 1647В связи с этим, при изложении последующих экспериментальных результатов исследований молекул САЧ были использованы проясненные в данной главе механизмы и закономерности энергетического поведения для металл-усиленной флуоресценции, но рассмотреныиные матрицы для достижения усиления спектрального сигнала, созданные на основе наноструктурированного серебра на подложке.В четвертой главе отражены результаты спектроскопических исследований структуры молекулы САЧ и поведения остатка Trp в норме и при сепсисе.
В результате примененияметодов колебательной спектроскопии (ИК-Фурье, КР, усиленное КР) были расшифрованыосновные полосы частот спектра белковой молекулы в области 800-1700 см-1, характеризующие ее вторичную структуру и ее изменения: Амид I, Амид II, Aмид III, скелетные колебания молекулы. Показано, что в случае исследований белка при сепсисе деформацию претерпевают группа Aмид I,III. С помощью ИК-Фурье спектроскопии (Рис. 2а, Рис. 2б) былизарегистрированы и идентифицированы основные группы колебаний САЧ, которые включали в себя характерные полосы колебаний Амид А - N-H (3317 см-1), колебаний связи C=O(1640-1660 см-1, полоса Амид I) и деформацией связи N-H (1520-1550 см-1, полоса Амид II) иразличных аминокислотных остатков, которые могут быть отнесены к Trp/Ser [15].
Установлено различие в интенсивности поглощения белковых молекул в норме и при сепсисе. В случае септического САЧ поглощение увеличивается от 1,8 до 11 раз в зависимости от амиднойгруппы.11АБРис. 2А. - ИК-Фурье-спектры поглощенияРис. 2Б. ИК-Фурье-спектры поглощенияСАЧ септических пациентов с отображе-САЧ септических пациентов с отобра-нием пиков групп Амид I, II (1642 см-1, 1525жением пиков групп Амид I, II (1650 см-1,см-1 соответственно) и пика Trp/Ser (10291520 см-1 соответственно) с разрешениемсм-1) с разрешением спектрального сигналаспектрального сигнала по методу Савиц-по методу Савицкого-Голея и последующегокого-Голея и последующего моделирова-моделирования с использованием функцииния с использованием функции Гаусса дляГаусса для септического САЧздорового САЧПо данным спектроскопии поверхностно-усиленного КР который был реализован сприменением синтезированных наноструктурированных шероховатых серебряных поверхностей (Рис.
3а), были идентифицированы и расшифрованы основные полосы частот спектрабелковой молекулы, характеризующие ее вторичную структуру: Амид I, Амид III и скелетных колебаний молекулы. Показано, что в случае исследований белка при сепсисе деформацию претерпевают группы Aмид I, Амид III, их связи С=O и водородные O–H связи соответственно, которые становятся более хаотичными. Также показано, что аминокислотный остаток тирозина (Tyr) может быть детектирован (1610, 1616 см-1) и упаковывается внутрь молекулярной структуры (характерный пик 807 см-1 не детектируется в случае септическогоСАЧ) (Рис 3б).12АБРис.
3А - АСМ-изображение поверхно-Рис. 3Б Спектры поверхностно-усиленногости электрохимически синтезированныхКР САЧ здоровых пациентов (синяя линия) ишероховантых пленок серебра для полу-пациентов, зараженных сепсисом (краснаячения поверхностно-усиленного сигналалиния), зарегистрированные при использова-КР: подложка усиления сигнала КР cнии подложек с АР 0,5 мкм. Возбуждение наанодным растворением слоя серебрадлине волны, время регистрации спектра –глубиной 0,5 мкм100 сДля сигнала поверхностно-усиленного КРС для САЧ, эффективное усиление сигналасоставило значение порядка 40 раз для САЧ при сепсисе на подложке со снятием слоя 0,5мкм. С помощью метода флуоресцентной спектроскопии были исследованы особенностифлуоресценции аминокислотного остатка триптофана-214.
Показано увеличениефлуоресценции аминокислотных остатковвследствие их комплексообразования и выходовостатков триптофана на поверхность, что подтверждается данными ИК-спектроскопии. По результатам исследования белковых молекул с помощьюметалл-усиленной флуоресценции была установлена возможность переноса плазмонной энергии вкомплексе НЧ-молекула белка по механизму ФёрРис. 4 - Спектры флуоресценции аминокислотного остатка Trp 214 САЧв норме (Кривая 1) и при сепсисе (кривая 2).
Длина волны возбужденияλ = 280 нмстера, рассчитаны параметры переноса. Показаныразличия параметров переноса для здоровых и септических молекул САЧ, Также показаны различияанизотропных свойств молекулы белка в норме ипри септической патологии. Было установлено, всоответствии с формулами (1-3), что константаскорости dd- переноса достигает порядка для здорового и септического белков составляет k dd13= 8,4·106 c-1 и 73·106 c-1 соответственно, эффективный радиус переноса и расстояние междумолекулой красителя и НЧ составляет R 0 = 2,4 нм и R 0 = 2,4 нм соответственно, радиус между молекулой НЧ и молекулой белка составляет: r = 4,0 нм и r = 3,6 нм соответственно. Врамках данной теории, коэффициент вращательной D вр диффузии может быть определен согласно выражениюr= 1 + 6 Dврτ ,r0(4)где r 0 – анизотропия для неподвижного флуорофора (зонда), τ – время жизни возбужденногосостояния молекулы САЧ.При известном времени жизни триптофаного остатка САЧ τ = 5,8 нс значение D вр составило 5·106 с-1 и 2,9·107 с-1 для САЧ с сепсисом и здорового САЧ соответственно.
Установлен факт значительного уменьшения коэффициента вращательной диффузии (на 82%) длямолекул САЧ с сепсисом и увеличение степени поляризации флуоресценции что указываетна разворачивание молекул САЧ при сепсисе, которое может происходить в результате еечастичной денатурации вследствие патологии.Пятая глава отражает результаты проведенных исследований, в результате которыхбыла разработана флуоресцентная методика анализа концентрации аденозинтрифосфата(АТФ) в клетках крови и митохондриях в различном состоянии клеточной гибели. Показано,что концентрации могут выступать АТФ может быть прогностическим маркером оценки состояния клетки в текущий момент времени.
Рисунок отражает значение концентраций АТФдля клеток, находящихся в состоянии позднего апоптоза – некроза (рис. 5).БАРис. 5 - Экспериментально определенные концентрации АТФ для клеток крови (А)и их митохондрий (Б). Детектирование проводилась в спектре свечениялюцеферина желтого (в видимом диапазоне 500 – 700 нм)с максимумом на длине волны 536 нмУстановлено, что количественное содержание молекул АТФ в клетках крови и митохондриях может быть оценено с помощью флуоресцентных методов исследования.14ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1. Экспериментально исследованы биосовместимые модельные матрицы шероховатого стекла и ПВС, с внедренными в них НЧ серебра и без НЧ. Показано, что оптическая спектроскопия адсорбатов молекул красителей и НЧ серебра в пленках ПВС и на поверхностишероховатых стекол позволяет получить и оценить эффективность обмена энергией, с использованием модели Фёрстера, между электронно-возбужденными и невозбужденными молекулами в среде.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
