Автореферат (1150383), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Подобный вариант может быть рекомендован длягруппового анализа белков.Таким образом, обнаружено, что исследуемый дендритный полимер выполняет двойнуюфункцию: выступает в качестве псевдостационарной фазы и модификатора поверхностикварцевого капилляра.13а)б)Рис.
8. Зависимость (а) времени миграции и (б) эффективности (N) при электрофоретическомразделении белков от концентрации полимера PEI-Mal С25 в фосфатном буферном растворе (рН 2,2).ДляувеличенияселективностистабильностиразделенияаналитовпокрытияисинтезированыPLOT-колонки на основе полимеров, макромолекулыкоторого ковалентно связаны со стенками капилляра(рисунок10).Изученывозможностивариантоввнутрикапиллярногоразличныхконцентрированиясиспользованием таких колонок.Рис. 9. ЭлектрофореграммамодельнойсмесибелковВвод пробы: 5с×30мбар.
КЭ:15кВ;λ=214нм. Рабочий электролит: 100мМ фосфатный буфер (рН 2,2).N= 400 000 т.т./м.Рис. 10. Схема синтеза PLOT-PEI-MAL колонки.Лучшее разделение наблюдалось в условиях КЭХпри рН 2,2 на PLOT-PEI-Malколонках. ЭОП – отрицательный; электрофоретическое разделение осуществляется приположительной полярности, поскольку аналиты имеют большой положительный заряд.Подобная ситуация независимо подтверждает обнаруженную ранее модификацию стенок14кварцевого капилляра дендритным полимером структуры С в условиях МЭКХ. Аналитическиехарактеристики подготовленных PLOT-дендритных колонок представлены в таблица 2.Присопоставимыхзначенияхэффективностииселективностиразделенияэлектрофоретическое разделение на колонках, модифицированных полимером структуры А,требует значительно меньшего времени анализа.
Для последующих экспериментов по поискувариантов on-line концентрирования взят полимер структуры А с массой ядра 25 кДа.Таблица 2. Сравнительная характеристика PLOT-дендритных колонок.Полимер А (90%) Полимер В (40%) Полимер С (20%)µ(ЭОП), минЭффективность (N), т.т./м7,5310,6612,93662007000058000Селективность (α) для пары Mio-Alb1,041,051,06Изучены различный варианты on-line концентрирования в условиях КЭХ: стэкинг сбольшим объемом образца (large volume sample stacking , LVSS), тот же вариант, но с «воднойпробкой» и электростэкинг в сочетании со стэкингом с большим объемом образца (таблица 3).Таблица 3.
Результаты on-line концентрирования белков с использованием PLOTколонок с сверхразветвленными полимерами в КЭХОпределяемые компонентыВариант концентрированияАльбуминЛизоцимМиоглобинИнсулинSEFS79 ± 150 ± 256± 268 ± 11. Стэкинг с большимивводимой пробы (LVSS)объемом Условия: матрица пробы – вода, ввод пробы(300сек×30 мбар)ПО, мкг/мл2,0SEFS81 ± 12. Стэкинг с большимвводимой пробы спробкой»(LVSS-HCFASS)2,02,562 ± 260 ± 282 ± 1объемом Условия: матрица пробы – вода,«водной Ввод воды (25сек×30 мбар), ввод пробы (300сек×30мбар)ПО, мкг/мл1,0SEFS1320 ± 13.
Электростэкинг с LVSS1,01,01,51,0970 ± 11040 ± 1340 ± 2Условия: матрица пробы – вода,Электрокинетический ввод пробы (15 кВ, 90 сек)ПО, мкг/мл0,20,10,20,515Для подтверждения отсутствия сорбции белков на поверхности полимера проведенасерия специальных экспериментов — методом эллипсометрии, позволяющим исследоватьповерхности и границы раздела различных сред.Нарисунок11приведенфрагментструктурыпленкисверхразветвленногополиэтиленимина на поверхности кварцевой пластинки. Толщина измеряемой пленки (d) иоптические константы (показатель преломления и коэффициент экстинкции) оценивалисьпутем сравнения измеренных величин Ψ (tan ψ – отношения амплитуд световой волны до ипосле отражения света) и Δ (относительная разность фаз колебаний этой волны) с такими жевеличинами, заданными для модели оптического слоя.Логика такого подхода представлена нарисунок12.
По данным эллипсометрическогоанализасинтезированнапластинкеслойполимера толщиной около 20 нм .Адсорбция белка на полимерной пленкеin situ исследовалась эллипсометрически втечении 30 мин. Затем, раствор, содержащийбелок, удалялся из кюветы пипеткой. Кпластинеснабухшимполимеромиадсорбированным белком в той же кюветедобавляли чистый буферный раствор длявыявления возможной десорбции белка in situРис. 11.
Структура полимерного слоя наповерхности кварцевой пластинки. PEI полиэтиленимин,Mal–мальтозныефрагменты.методом эллипсометрии. Пример результатовэкспериментаповыявлениювозможнойадсорбции/десорбции белка представлен нарисунок 13. Видно, что процесс адсорбциипроисходитпочтимгновенноиявляетсянеобратимым. Из результатов представленныхвтаблица4адсорбированногоследует,чтоколичествобелка при pH 2,2 непревышает 1 мг/м2, что соответствует < 0,1%от общего его содержания в растворе.Рис. 12. Основные этапы анализа методомэллипсометрии.16Таким образом, в этих условияхколичественныхпотерьбелковэлектрохроматографическомприопределениипрактически не происходит. Но при pHрабочегобуфераадсорбированного8,5толщинализоцимаслояоказаласьравной ~ 18 нм (это соответствует 4 мг/м2,Рис.
13. Результат эксперимента повыявлению возможной адсорбции/десорбциибелка методом эллипсометрии. А – первыйэтап: набухание полимерной пленки; Б –второй этап: процесс адсорбции белка; В –третий этап: процесс десорбции белка.или 0,4%, от общего содержания белка врастворе).Незначительноеувеличениеадсорбции связано с тем, что лизоцим(pI=11,0) имеет противоположный полимерузаряд,иегомолекулымогутэлектростатически притягиваться к поверхности полимерной пленки.С целью сопоставления результатов, полученных на PLOT-колонках, содержащих PEIMal в качестве стационарной фазы, синтезированы полиметакрилатные PLOT-колонки, наосновеглицидилметакрилата,метилметакрилатаиэтиленгликольдиметакрилата.споследующей постфункционализацией N-бутилэтиламином для формирования ЭОП.Таблица 4.
Исследование адсорбции белков на поверхности полимерной пленки при pHбуферного раствора 2,2 и 8,5.БелокАльбуминСКО, %ЛизоцимСКО, %ИнсулинpH 2,2№123456722,1%123456713,49%1dэфф, нм2,83,13,11,92,12,01,9m [мг/м²]0,70,70,70,50,50,50,51,91,61,51,71,61,81,20,50,40,40,40,40,40,32,00,5pH 8,5№12345dэфф, нм2,072,253,022,332,54m [мг/м²]0,50,50,70,60,617,912,113,916,44,32,93,33,913,4%123414,95%11,00,317СКО, %МиоглобинСКО, %Получены23410,80%12314,19%1,81,61,50,40,40,454,03,61,21,00,9оценочныехарактеристики2326,15%12334,23%методов1,52,00,40,51,00,40,90,20,10,2КЭХ,КЗЭиЭКХприэлектрофоретическом разделении белков (таблица 5).Таблица 5. Сопоставлениеаналитических характеристик методов КЭХ и КЗЭ приэлектрофоретическом разделении белков с участием дендритных полимеровКонтроллируемыйпараметрКЗЭМЭКХПолые колонки (КЭХ)Метакр.PEI-MalА и В:Эффективность (т.т./м)10÷15 тыс.
10÷30 тыс. 56 тыс.С: до 4*105А и В:Предел обнаружения, мг/мл 0,08÷0,15 0,08÷0,10 0,02÷0,05С: 0,005Время анализа, мин6106Фактор селективности (α)1,00÷1,30 1,01÷1,041,03Воспроизводимостьпараметров миграции (RSD,2,80,80,8%)50÷70 тыс.0,01÷0,041÷2,5 мкг/мл(конц.)251,05÷1,100,5Монолитныеколонки25÷35 тыс.0,02÷0,06101,50÷2,100,5Лучшие результаты по эффективности, селективности разделения и воспроизводимостипараметров миграции отмечены в условиях капиллярной электрохроматографии (КЭХ). Приэтом колонки, модифицированные СРП, имеют более простую процедуру синтеза и лучшуювоспроизводимость покрытия поверхности кварцевого капилляра.В оптимизированных условиях с использованием PLOT-колонок с покрытиемсверхразветвленным полимером PEI-Mal проведен анализ реальных объектов (сыворотка кровии моча).Пробоподготовка в случае сыворотки крови заключалась в фильтрации пробы черезстекловолоконный и мембранный (инертный к белкам) микрофильтр с размерами пор 1-2 мкм и0,2 мкм, соответственно.
При анализе белков в моче задача осложнялась тем, что в мочеприсутствуют низкомолекулярные компоненты самой разнообразной химической природы,включая пигменты, которые могут находиться в очень больших концентрациях. Эти вещества18поглощают при тех же длинах волн, что и белки (200-214 нм). Поэтому передэлектрофоретическим разделением белков необходима была предварительная очисткабиологической жидкости.Обессоливаниеидепигментацию мочи проводили насамопроточнойгелеммини-колонкеSefadexG25с(пределисключения по белкам М=10000)(рисунок14).Электрофореграмма экстрактаРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
