Автореферат (1150383), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Диссертационная работа состоит из введения, обзоралитературы, экспериментальной части, 5-ти глав с обсуждением полученных результатов,списка принятых сокращений, заключения, списка цитируемой литературы (90 наименований),приложений. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 79 рисункови 15 таблиц.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо Введении дано обоснование актуальности темы и сформулирована цельисследования.Отмеченасверхразветвленныхцелесообразностьполиэтилениминоввиспользованиякачествемальтозилированныхкомпонентовстационарныхипсевдостационарных фаз (КЭХ и МЭКХ) для разделения белков.1-я глава (Обзор литературы) включает разделы, в которых обсуждаются физикохимические методы определения белков, варианты on-line концентрирования, особенностиприменения PLOT-колонок в КЭХ; строение и классификация сверхразветвленных полимеров,областиихприменениявметодахразделения;особенностииспользованияметодаэллипсометрии для контроля сорбции белков.Во 2-й главе (Экспериментальная часть) Рассматривается характеристика объектов иметодов исследования, особенности синтеза монолитных и PLOT-колонок на основеметакрилатныхисверхразветвленныхполимеров,условияанализовврежимахэлектрокинетической хроматографии (ЭКХ), капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) икапиллярной электрохроматографии (КЭХ), условия эллипсометрического получения данныхпосорбциибелков,пробоподготовкабиологическихвоспроизводимости покрытия подготовленных колонок.жидкостей,алгоритмоценки73-яглавамодифицированныхпосвященамальтозойвозможностямисверхразветвленныхполиметакрилатныхполимеровполиэтилениминов,каккомпонентовэлектрофоретических систем, стационарных и псевдостационарных фаз при определениибелков методом ЭКХ и КЭХ.Капиллярная электрохроматография – активно развивающийся гибридный метод,позволяющий существенно расширить возможности аналитической химии.
Его специфика, вотличие от ВЭЖХ, состоит в том, что гидродинамический поток подвижной фазы заменяетсяэлектроосмотическим (ЭОП), формирующимся вкапиллярной колонке при наложениивнешнего электрического поля. Плоский профиль потока объясняет и большую эффективностьв КЭХ по сравнению с ВЭЖХ. В настоящее время этот метод активно востребован впротеомике при определении пептидов и белков. При этом возникают проблемы: сорбциябелков на стенкахкварцевого капилляра и высокие пределы обнаружения, затрудняющиеиспользование этого метода в практике клинической медицины.Возможные решения первой проблемы: использование динамического покрытия в КЗЭ,введение в состав буферного электролита псевдостационарной фазы (ЭКХ), создание тонкогопористого слоя полимера на внутренней поверхности кварцевого капилляра (PLOT-колонки),заполнение капилляра монолитным сорбентом (КЭХ).
Все эти варианты изучены и реализованыв данной работе.Решение другой проблемы – снижение пределов обнаружения – мы видим в поискеподходящих вариантов on-line концентрирования, позволяющих получать сопоставимые сВЭЖХ отношения сигнал/шум. Традиционно для концентрирования аналитов в КЭ используютстэкинг, свипинг и динамический pH скачок. В данной работе уделено особое внимание такимвариантам внутрикапиллярного концентрирования как стэкинг с большим объемом образца(large volume sample stacking, LVSS), стэкинг в сочетании с «водной пробкой» и электростэкингс LVSS.В работе проведено комплексное исследование по выявлению влияния дендритныхполимеров на основесверхразветвленного полиэтиленимина, различающихся степеньюфункционализации мальтозой (PEI-Mal) и массой ядра (5 и 25 кДа) на разделение смесистандартов белков (рисунок 1).Была выдвинута гипотеза (рисунок2): обсуждаемые полимеры могли бы выполнить рольпсевдостационарной и/или стационарной фаз, а также модификатора поверхности кварцевогокапилляра, тем самым препятствуя сорбции белков и влияя на эффективность и селективностьих разделения.
В качестве модельной системы выбрана смесь белков (лизоцим, миоглобин,8инсулин и альбумин) с широким диапазоном молекулярных масс (Mr = 6000÷66000 Да) изначений изоэлектрических точек (pI = 5,5÷11,0).Рис.1.Исследуемыеполимерысверхразветвленногополиэтиленимина,модифицированные мальтозой (PEI-Mal). Схема синтеза PEI-Mal описана в [1]1.Рис. 2. Реализация различных вариантов КЭ с участием мальтозилированныхсверхразветвленных полиэтилениминов.1Appelhans D., Komber H., Voit B. et al. // Biomacromolecules. 2009.
V. 10. P. 1114-11249ЭлектрофоретическиеэкспериментыразличныхпроводилисьзначенияхpH,привыборкоторых сделан на основании величинизоэлектрическихточекбелковиядраиполимеров (рисунок 3)2.Выявленооболочкинавлияниепараметрымиграциибелков. Наибольшее взаимодействие сРис.
3. Зависимость заряда полимера от рН дляPEI-Mal-A, PEI-Mal-В и PEI-Mal-C (концентрацияполимеров 0,5мг/мл) [2].аналитами обнаружено для полимеровс массой ядра 25 кДа. Время миграции(особенно в случае инсулина) в случаебольшей массы полимера существенновозрастает (рисунок 4).Привведениивбуферныйэлектролит полимеров структуры А (смаксимальнойолигосахариднымимодификациейфрагментами)иразличной массой ядра (5 и 25 кДа)существенных различий в параметрахмиграции не обнаружено (рисунок 5).Поэтому для проведения дальнейшихРис. 4. Зависимость времен миграции белков отконцентрации полимеров PEI-Mal B5 и PEI-Mal В25 всоставе боратного буферного раствора (pH 8,5).детальныхисследованийвзятыполимеры с массой 25кДа.Электрокинетическая хроматография.
При всех выбранных значениях pH увеличениеконцентрации полимера в составе рабочего электролита приводило к снижению скорости ЭОП.При pH 10,2 (боратный буферный раствор)молекулы дендритных полимеров,независимо от степени функционализации мальтозой, заряжены отрицательно (рисунок 3); онине взаимодействуют с отрицательно заряженной поверхностью кварцевого капилляра и неизменяют направление и скорость электроосмотического потока.2Klajnert B., Appelhans D.
et al. // J. Chem. Eur. J. 2008. Vol. 14. P. 7036-704110а)б)Рис. 5. Зависимость селективности разделения () белков в ЭКХ от концентрации полимера.а) PEI-Mal A25; б) PEI-Mal A5; боратный буферный электролит (рН 8,5).М – миоглобин, И – инсулин, А – альбумин.При введении полимера PEI-Mal А в рабочий буфер отмечено незначительное изменениеэлектрофоретических подвижностей белков.
Напротив, введение PEI-Mal B в концентрациях >4мг/мл привело к заметному увеличению параметров миграции, особенно для инсулина иальбумина. Учитывая постоянное значение тока в капилляре во время электрофоретическиханализов (таблица 1) как показателя изменения ионной силы рабочего электролита, можнозаключить, что повышение времен миграции свидетельствует о взаимодействии молекулполимераPEI-MalBсмакромолекуламиинсулинаиальбуминасобразованиемсоответствующих агрегатов, а не об увеличении ионной силы буферного электролита.Таблица 1. Значения тока внутри капилляра во время анализа при введении PEI-Mal всостав рабочего буфера (pH 10,2)КонцентрацияPEI-Mal-A, мг/млТок, мАОбразецКонцентрация PEIMal B25, мг/мл055-5655ДМСОБелки*00,554.55554.5ДМСОБелкиБелки0,55856.5575554545655.556.0ДМСОБелкиБелкиДМСОБелкиБелкиДМСОБелкиБелки124124Ток, мАОбразец53-54545253535454545554,555,555,554,555,055,5ДМСОБелкиДМСОБелкиБелкиБелкиДМСОБелкиБелкиДМСОБелкиБелкиДМСОБелкиБелки1157ДМСО54,5ДМСО857.0Белки55,5Белки*Белки – водный раствор стандартов белков (миоглобин, инсулин, альбумин), 1 мг/мл.8По сравнению с режимом капиллярного зонного электрофореза введение полимеров вборатный буферный раствор (pH 8,5) привело к росту эффективности и селективностиразделения (рисунки 6, 7).
Параметры миграции аналитов сохранялись даже при последующихэлектрофоретических экспериментах, в которых рабочий буфер не содержал добавки полимера,что свидетельствует о модификации последним стенок кварцевого капилляра.а)б)Рис. 6. Зависимость (а) селективности разделения (α) и (б) эффективности (N) при разделениибелков от концентрации полимера PEI-Mal A25 в боратном буфере (рН 8,5);М – миоглобин, И – инсулин, А – альбумин.Это приводит к усилению электростатических взаимодействий между положительнозаряженными аминогруппами полиэтиленимина и отрицательно заряженными силанольнымигруппами ОН стенок кварцевого капилляра; ЭОП отсутствует: взаимодействия молекулполимера с отрицательно заряженными молекулами аналитов возрастают.Рис.
7. Электрофореграмма модельной смеси белков (лизоцим, миоглобин, инсулин, альбумин).Ввод пробы: 5с×30мбар; 15кВ; λ=214 нм. Рабочий электролит: 75 мМ боратный буфер (рН 10,2). а) Бездобавки полимера PEI-Mal A25 в составе буфера; б) с добавкой полимера PEI-Mal A25 в боратныйбуфер.1 – лизоцим, 2 –миоглобин, 3 – инсулин, 4 – альбумин.12Факт модификации подтвержден и при pH 2,2 (фосфатный буферный раствор).
В этихусловиях диссоциация силанольных гидроксильных групп капилляра подавлена;ЭОПотсутствует, молекулы полимеров обладают значительным положительным зарядом за счетпротонирования аминогрупп полиэтилениминового ядра (значение pH рабочего буфера нижеизоэлектрической точки полимеров). При введении PEI-Mal в состав буфера наблюдаетсяобращение ЭОП, что объясняется следующим: молекулы полимеров адсорбируются наповерхности капилляра с формированиемкатионного динамического покрытия. Этоспособствует генерации анодного электроосмотического потока.Проведена оценка полученного динамического покрытия: воспроизводимость повеличине ЭОП от анализа к анализу составила 1,4-3,3% (n=50); день/день 3,6-4,4 % (n=50).Высокая стабильность покрытия обеспечила и воспроизводимость времен миграции аналитов(от анализа к анализу 1,6-1,8% (n=5); день/день 2,0-3,1 % (n=5))Обнаружено, что при концентрациях полимера 0 – 5 мг/мл с уменьшением плотностимальтознойоболочкипроисходитувеличениеэффективныхэлектрофоретическихподвижностей (µэф) аналитов, т.е.
более сильные взаимодействия с молекулами белковхарактерны для полимеров структуры С (содержание Mal – 20%): мальтозные фрагменты вменьшей степени участвуют во внутримолекулярных водородных связях. Это, в свою очередь,обеспечивает возможность более активного взаимодействия с силанольными группамикапилляра.
С увеличением концентрации полимера С в составе рабочего буфера генерируетсяотрицательный ЭОП, чтопрепятствует сорбцииположительно заряженных аналитов настенках кварцевого капилляра. В результате скорость миграции белков уменьшается,селективность разделения снижается, а эффективность возрастает до 4*105 т.т./м; наблюдаетсяэффект концентрирования (рисунки 8, 9).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
