Диссертация (1150381), страница 16

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 16)

Было показано, что ФОС, в томчисле и зарин, способны взаимодействовать с белками крови [111], в том числе ссывороточнымальбумином,чтофосфонилированныхбелков,афосфонилированныхпептидовприводитпосле(содержащихкобразованиюферментативногоостатокэфирааддуктовгидролиза–иметилфосфоновойкислоты), которые могут являться долгоживущими маркерами интоксикации ФОС.В последние годы успешно проводится разработка методик извлечения избиообразцов фосфонилированных пептидов с использованием метода металлаффинной хроматографии. Одним из применяемых в этих целях сорбентов являетсякоммерческий гель PHOS-Select Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich), содержащийжелезо(III). Ранее в работах [112, 113] была показана возможность выделения аддуктовфосфорорганических соединений с сывороточным альбумином методом металлаффинной хроматографии на указанном сорбенте, однако, информация относилась ктакимФОС,какпараоксониRVx,овыделенииаддуктовсдругимифосфорорганическими соединениями данные отсутствовали.

Поэтому представлялосьинтересным показать возможность селективного извлечения фосфонилированныхпептидов на разработанных МХС Fe(III) и МОС Fe(III) на примере ранее неисследованного аддукта.Известно, что основной мишенью для присоединения зарина к молекулеальбумина является тирозин-411 [114], соответственно, в пептическом гидролизатесывороточногоальбуминачеловека,модифицированногозарином,могут93присутствовать два пептида 1638.9 Да (LVRYзаринTKKVPQVST) и 1525.8 Да(VRYзаринTKKVPQVST), содержащие тирозин-411, модифицированный остаткомзарина (сдвиг массы относительно нативных пептидов составляет 120 Да). Следуетотметить низкую интенсивность сигналов этих пептидов в масс-спектре исходногообразца (рисунок 36.А).

Это обусловлено соотношением 1:100 между количествамимодифицированного зарином сывороточного альбумина человека и нативного.LVRYзаринTKKVPQVSTВБVRYзаринTKKVPQVSTАРисунок 36 – Масс-спектр образца, содержащего гидролизат сывороточного альбуминачеловека, обработанного зарином в концентрации 0.1 мг/мл: А – до металл-аффиннойхроматографии; Б – после металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III)(элюирование 0.5% водным раствором пиперидина); В – после металл-аффиннойхроматографии на МОС Fe(III) (элюирование 15% ПФОС в 0.5% водном растворепиперидина)94После проведения металл-аффинной хроматографии на сорбенте МХС Fe(III) (п.2.6.5) и масс-спектрометрического анализа методом МАЛДИ (п.

2.7.1) в масс-спектрахэлюата (0.5% водный раствор пиперидина) были надежно детектированы сигналы,соответствующие двум указанным выше аддуктам (рисунок 36.Б). Аналогичныерезультаты были получены и при использовании МОС Fe(III), элюирование проводили15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидине (рисунок 36.В).Наличие модификации в пептидах было доказано методом тандемной массспектрометрии по отщеплению нейтральной частицы (рисунок 37).Рисунок 37 – Определение наличия модификации остатком зарина в фрагментныхмасс-спектрах пептида LVRYзаринTKKVPQVSTСледует отметить, что практически полное отсутствие примесных сигналовсвидетельствует о высоком уровне специфичности МХС Fe(III) к фосфонилированнымпептидам.Таким образом, показана возможность селективного выделения аддуктов заринаспептидамисывороточногоальбуминачеловекаметодомхроматографии на новых сорбентах, содержащих железо (III).металл-аффинной95Основные результаты41Впервыепоказанавозможностьиспользованияколлапсированныхмонослоев- пленок Ленгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(III) – МХС Fe(III) –в качестве сорбентов для металл-аффинной хроматографии.2Впервые золь-гельсинтезом,методом с совместным самораспространяющимсяиндуцированныммикроволновымизлучением,былиполученынаноразмерные структуры на основе оксида железа(III) – МОС Fe(III).

Установлено,что размер полученных частиц составляет 20-50 нм. Показана возможность ихиспользования в качестве металл-аффинных сорбентов.3Изученыструктурыповерхностисорбентовметодомсканирующейэлектронной микроскопии. Определены физико-химические свойства полученныхструктур МХС Fe(III) и МОС Fe(III): удельная поверхность (15 и 60 м2/гсоответственно), изоэлектрическая точка (рН 3.5 и 5.5 соответственно).4Определена сорбционная емкость МХС Fe(III) и МОС Fe(III) по пептидуSSNGHV(pY)EKLSSI (0.035 и 0.019 мкмоль/мг соответственно), изучены изотермысорбции белка казеина быка (casein Bos Taurus) и фосфорилированных пептидов,показано, что они соответствуют теории Ленгмюра.5Оптимизированы условия выделения фосфорилированных пептидов с цельюповышения селективности анализа.

Показано, что добавление перфтороктановойсульфокислоты к элюенту приводит к улучшению десорбции фосфорилированныхпептидов с разработанных сорбентов и, соответственно, повышению степени ихизвлечения.6Показанавозможностьиспользованияразработанныхсорбентоввфосфопротеомном анализе, исследованы специфичность и селективность сорбентов напримере фосфорилированных триптических пептидов казеина быка и синтетическихпептидов,фосфорилированнымпоразличнымаминокислотам.Показано,чторазработанные сорбенты обладают высокой селективностью и могут быть примененыдля анализа биологических образцов.7Впервые показана возможность селективного выделения аддуктов зарина спептидамисывороточногоальбуминачеловекахроматографии на сорбентах, содержащих железо (III).методомметалл-аффинной96Список сокращенийБЭТ – метод Брюнера–Эммета–ТеллераВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматографияВЭЖХ-МС – высокоэффективная жидкостная хроматография с массспектрометрическим детектированиемВЭЖХ-УФ – высокоэффективная жидкостная хроматография сультрафиолетовым детектированиемМАХ – металл-аффинная хроматографияМОАХ – металлоксидная аффинная хроматографияМОС – металл-оксидный сорбентПАВ – поверхностно-активное веществоПФОС – перфтороктановая сульфокислотаМХС – металл-хелатный сорбентТрис – трис(гидроксиметил)аминометанТФУ – трифторуксусная кислотаЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаCID – collision induced dissociationDHB – 2,5-dihydroxybenzoic acid, 2,5-дигидроксибензойная кислотаIDA – iminodiacetic acid, иминодиуксусная кислотаIMAC – immobilized-metal affinity chromatographyМАЛДИ –матрично-активированная лазерная десорбция/ионизацияNTA – nitrilotriacetic acid, нитрилотриуксусная кислотаTOF – time-of-flight, времяпролетный97Список литературы1Leitner A.

Phosphopeptide enrichment using metal oxide affinity chromatography// Trends in Analytical Chemistry – 2010. – Vol. 29, N 2. – P. 177–185.2Batalha I.L., Lowe C.R., Roque A.C.A. Platforms for enrichment ofphosphorylated proteins and peptides in proteomics // Trends in Biotechnology. – 2011. –Vol. 30, N 2. – P. 100-110.3Рожкова Е.А., Краснов И.А., Суходолов Н.Г., Иванов Н.С., ПодольскаяЕ.П., Янклович А.И., Краснов Н.В. Исследование свойств наноструктур (пленокЛенгмюра-Блоджетт), содержащих ионы железа, и определение их состава спривлечением методов масс-спектрометрии // Научное приборостроение.

– 2008. –Т.18, № 4. – С. 54-61.4Селютин А.А., Колоницкий П.Д., Суходолов Н.Г., Шрейнер Е.В., КрасновН.В., Подольская Е.П. Синтез и характеризация нанорегулярных сорбентов на основеоксида циркония // Научное приборостроение. – 2013. – Т.23, №1. – С. 115-122.5Machida M., Kosako H., Shirakabe K., Kobayashi M., Ushiyama M., Inagawa J.,Hirano J., Nakano T., Bando Y., Nishida E., Hattori S. Purification of phosphoproteins byimmobilized metal affinity chromatography and its application to phosphoproteome analysis// FEBS J. – 2007. – Vol. 74, N 6. – P. 1576-1587.6Li B., Schopfer L.M., Hinrichs S.H., Masson P., Lockridge O. Matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of- flight mass spectrometry assay for organophosphorustoxicants bound to human albumin at Tyr411 // Analytical Biochemistry.

– 2007. – V. 361. –P. 263–272.7Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metalchelate affinitychromatography. A new approach to protein fractionation // Nature. – 1975. – V. 258. – P.598–599.8Knecht S., Ricklin D., Eberle A. N., Ernst B.

(2009). Oligohis-tags: Mechanismsof binding to Ni2+ -NTA surfaces // J. Mol. Recognit. – 2009. – V. 22. – P. 270–279.9Walsh P. S., Metzger D. A., Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simpleextraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // BioTechniques. – 1991. –V. 10. – P. 506–513.9810Takeda N., Matsuoka T., Gotoh M. Potentiality of IMAC as sample pretreatmenttool in food analysis for veterinary drugs // Chromatographia.

Характеристики

Список файлов диссертации