Диссертация (1150381), страница 15
Текст из файла (страница 15)
2.7.3). В качестве сорбентасравнения был выбран коммерческий железо(III)-содержащий гель PHOS-Select™ IronAffinity Gel (Sigma Aldrich). Все используемые сорбенты были взяты в равныхколичествах по массе сухого вещества.МХС Fe(III)МОС Fe(III)Iron Affinity GelРисунок 31 – Диаграммы степеней извлечения синтетических пептидов после металлаффинной хроматографии на МХС Fe(III), МОС Fe(III) и Iron Affinity Gel85Обаисследуемыхсорбентадемонстрируютвысокуюселективностькфосфорилированным пептидам (1р, 1рр, 2р, 2рр, 3рр, 4р, 5р) по сравнению снефосфорилированными (1, 2, 3, 4) (рисунок 31). Хорошо видно, что последниепрактически отсутствуют в элюате, тогда как первые имеют сравнительно высокуюстепень извлечения (рисунок 31, таблица 5 приложения). При этом существует четкаяобратная зависимость между pI пептида и его степенью извлечения.
Например, в ряду2->1->3->4 чем ниже pI, тем выше степень извлечения, а значит и их неспецифическаясорбция. В ряду 2рр->1рр->3рр наблюдается схожая корреляция для МХС Fe(III) иобратная для МОС Fe(III). Это может быть обусловлено большим сродством фазыМХС Fe(III) к анионным пептидам по сравнению с МОС Fe(III). Следует отметитьтакже более высокую специфичность выделения дифосфорилированных пептидов посравнению с монофосфорилированными, причем особенно значимо это проявляетсяпри использовании МХС Fe(III).Сорбент сравнения в целом проявляет аналогичную специфичность поотношению к разной степени фосфорилирования каждого пептида, однако, степениизвлечения при его использовании для большинства пептидов ниже.3.5.3Оптимизация условий металл-аффинной хроматографии триптическогогидролизата казеинаКак было отмечено выше, казеин является нативно фосфорилированным белком,и поэтому его удобно использовать в качестве модельного объекта.
Посколькусодержание фосфорилированных пептидов в его гидролизате составляет не более 5%от общего числа пептидов, и зачастую, пептиды, содержащие такие аминокислоты, каксерин и тирозин, способны взаимодействовать с сорбентом, необходимо использоватьдостаточное количество сорбента, чтобы избежать его пересыщения. Был проведен рядэкспериментов по подбору оптимальных условий извлечения фосфорилированныхпептидов из триптического гидролизата казеина.
Количества используемых сорбентовбыли приведены к одинаковому уровню по массе сухого вещества. В соответствии свышеприведенными положениями, были выбраны параметры проведения металлаффинной хроматографии (таблица 24).86Таблица 24 – Условия металл-аффинной хроматографии триптического гидролизатаказеинаКоличество сорбентаКоличество гидролизата казеина,мкг/«колонку»Набор элюентовВыбранные фосфорилированныепептиды и их pIМХС Fe(III) 200 дм2МОС Fe(III) 5.8 мгМХС Fe(III) 100 дм2IIМОС Fe(III) 2.9 мгIII 18IV 91) 0.4 М водный раствор аммиака2) 0.5 % водный раствор пиперидина3) 15% ПФОС в 0.5% водном растворпиперидинаFQ(pS)EEQQQTEDELQDK 3.43YKVPQLEIVPN(pS)AEER 4.56TVDME(pS)TEVFTK3.83IДля установления оптимального соотношения сорбент/аналит были опробованытри возможных сочетания: I-III (соотношение сорбент : аналит 310:1), II-III(соотношение сорбент : аналит 155:1), I-IV (соотношение сорбент : аналит 620:1)(таблица 24).
Эксперимент был проведен по методике 2.6.3, количественный анализтрех параллельных экспериментов проводили методом ВЭЖХ-МС (п. 2.7.3).Результаты для пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK представлены на рисунке 32 и втаблице 6 приложения. Фракции проскока и промывки, так же, как три фракцииэлюатов были объединены между собой.Использование меньшего количества сорбента (рисунок 32.А) по сравнению свариантами Б и В приводит к уменьшению степени извлечения целевого пептида всвязи с увеличением содержания его в проскоке, что особенно проявляется в случаеМХС Fe(III). В то же время, уменьшение нагрузки на сорбент приводит к увеличениюпотерь на нем (рисунок 32.В). Это можно объяснить тем, что при меньшем количествепептидов снижается конкуренция за свободные активные центры сорбции, чтоприводит к более прочному связыванию с сорбентом.87АБВРисунок 32 – Диаграммы степеней извлечения пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK вразличных фракциях при проведении металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III)и МОС Fe(III): А – вариант II-III; Б – вариант I-III; В – вариант I-IV.Таким образом, оптимальными оказались условия I-III (рисунок 32.Б), именно вэтом случае степень извлечения фосфорилированного пептида наивысшая (70-80%) какв случае МХС Fe(III), так и МОС Fe(III), а потери на сорбентах минимальны (не более25%) при отсутствии пептида в проскоке.
Обработка данных по двум другим пептидам(YKVPQLEIVPN(pS)AEER и TVDME(pS)TEVFTK) показала в целом аналогичныерезультаты (рисунки 5, 6 приложения, таблицы 7, 8 приложения).88Описанный выше эксперимент проводили по методике последовательногоэлюирования, предложенной в п. 3.5.2 для пептида, фосфорилированного по тирозину.Однако, для триптических пептидов казеина, фосфорилированных по серину, такойподход может быть неоправданно сложным. Поэтому было проведено сравнение двухвариантов элюирования одними и теми же растворителями: последовательного ипараллельного, на примере пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK (рисунок 33, таблица 9приложения).Распределение пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK по фракциям в условиях I-IIIпредставлено на рисунке 33.А.
Как и в случае экспериментов с тау-пептидами,основная доля пептида приходится на фракцию 0.4 М водного раствора аммиака, востальных фракциях количество извлеченного пептида снижается. Соответственно,можно ожидать, что при использовании каждого растворителя по отдельности степениизвлечения могут быть достаточно высокими. Однако, несмотря на то, чтоэлюирование было проведено двойным объемом каждой из подвижных фаз, результатоказался хуже, чем в случае последовательного элюирования (рисунок 33.Б).БАРисунок 33 – Диаграмма степеней извлечения пептидаFQ(pS)EEQQQTEDELQDK в различных фракциях при проведении металл-аффиннойхроматографии на МХС Fe(III) и МОС Fe(III): А – параллельное элюирование; Б –последовательное элюированиеЭлюирование одним растворителем позволяет достигать степеней извлечения60% для 0.5% водного раствора пиперидина и 30% и 50% при использовании водного89раствора аммиака и 15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина соответственно, вто время как суммарное использование этих подвижных фаз приводит к увеличениюстепени извлечения до 75-80%.
Поэтому можно сделать вывод, что для достижениянаилучшего результата применение предложенной выше методики необходимо.Экспериментальныеданные(YKVPQLEIVPN(pS)AEERидлядвухдругихTVDME(pS)TEVFTK)пептидовполностьюказеинасогласуютсясполученными результатами.Таким образом, можно сформулировать оптимальную методику для извлеченияфосфорилированных пептидов из сложных смесей с использованием разработанныхсорбентов:1) соотношение сорбент : аналит 310:1 по массе;2) сорбция и промывка в кислых растворах (рН 2-3);3) десорбция последовательно 0.4 М водным раствором аммиака, 0.5%водным раствором пиперидина и 15% ПФОС в 0.5% водном растворепиперидина.После определения оптимальных условий анализа, следующим этапом работыстало проведение металл-аффинной хроматографии триптического гидролизатаказеина в условиях I-III на трех сорбентах (МХС Fe(III), МОС Fe(III) и сорбентсравнения PHOS-Select™ Iron Affinity Gel), количества которых были приведены кодинаковому уровню по массе сухого вещества.
Количественный анализ трехпараллельных экспериментов проводили методом ВЭЖХ-МС (п. 2.7.3). Стоитотметить,чтофракцииэлюатовбылиобъединеныпередхроматомасс-спектрометрическим анализом.Для всех трех пептидов при использовании Iron Affinity Gel степени извлеченияоказались существенно ниже, при этом большая часть пептида оказалась в проскоке (неменее 45%) (рисунок 34, таблица 25). Это можно объяснить тем, что количествовзятого сорбента оказалось ниже, чем указано в инструкции по применению. В связи сэтим возникла необходимость проведения эксперимента в условиях, рекомендованныхпроизводителем, и соотношение сорбент : аналит составило 8000:1 (рисунок 34.А).
Какпоказанонарисунке,дажевэтихусловияхоколо10%пептидаFQ(pS)EEQQQTEDELQDK осталось в проскоке, а степень извлечения не превысилазначения для МХС Fe(III) и МОС Fe(III).90АРисунок 34 – Диаграммы степеней извлечения пептидов FQ(pS)EEQQQTEDELQDK,YKVPQLEIVPN(pS)AEER и TVDME(pS)TEVFTK в различных фракциях припроведении металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III) и МОС Fe(III) и IronAffinity GelТаблица 25 – Степени извлечения фосфорилированных пептидовСтепень извлечения, %Фракция МХС Fe(III) МОС Fe(III) Iron Affinity Gel Iron Affinity Gel, 8000:1FQ(pS)EEQQQTEDELQDKПроскокЭлюатПотери0±072 ± 728 ± 40±078 ± 222 ± 344 ± 511 ± 544 ± 5YKVPQLEIVPN(pS)AEERПроскокЭлюатПотери0±081 ± 519 ± 50±078 ± 522 ± 562 ± 54±234 ± 5TVDME(pS)TEVFTKПроскокЭлюатПотери0±096 ± 24±20±073 ± 427 ± 488 ± 54±18±510 ± 265 ± 515 ± 591Соответственно, эксперимент показал, что по специфичности, селективности исорбционной емкости разработанные сорбенты имеют значительное преимуществоперед их коммерческим аналогом.3.5.4Фосфопротеомный анализ клеточного лизата HeLaДля оценки применимости новых сорбентов при работе со сложнымибиологическими смесями, в Центре Биотехнологий и биомедицины УниверситетаЛейпцига было проведено испытание МХС Fe(III) и МОС Fe(III) на триптическомгидролизате клеточного лизата линии HeLa (п.
2.7.5). Известно, что эта клеточнаялиния содержит большое количество фосфорилированных белков. Для контроля былипроведены аналогичные эксперименты с использованием коммерческого сорбентаPHOS-Select™ Iron Affinity Gel. Стоит отметить, что для этого эксперимента количествокоммерческого сорбента было взято в соответствии с рекомендациями производителя,в то время как МХС Fe(III) и МОС Fe(III) – с условиями, определенными в результатеоптимизации: в пересчете на массу сухого вещества количество Iron Affinity Gel было в25 раз больше, чем количество каждого из разработанных сорбентов.Рисунок 35 – Диаграмма Эйлера для результатов определения фосфорилированныхпептидов в триптическом гидролизате лизата клеточной линии HeLa92Был проведен ВЭЖХ-МС-МС анализ объединенных фракций элюатов (п.
2.8.4).По результатам поиска в белковой базе данных SwissProt по фосфорилированнымпептидам было идентифицировано: при использовании МХС Fe(III) 1015 белков; вслучае МОС Fe(III) – 863; для Iron Affinity Gel – 918 белков (рисунок 35). При этомтолько 305 белков совпадают для всех трех сорбентов, что подтверждает различнуюспецифичность сорбентов к пептидам разной природы.3.5.5Выделение пептидов альбумина, модифицированных остатком заринаКруг фосфорсодержащих соединений, представляющих интерес в протеомноманализе,неограничиваетсяфосфорилированнымибелкамиипептидами.Кфосфорорганическим соединениям (ФОС) относится ряд пестицидов, а также боевыхотравляющих веществ: зарин, зоман, RVx и другие.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
