Диссертация (1150381), страница 14
Текст из файла (страница 14)
2.5.3). Содержание несорбированного пептидаопределяли методом ВЭЖХ-УФ (п. 2.7.2). По его содержанию в проскоке76рассчитывали удельную сорбционную емкость на площадь монослоя (мкмоль/дм2).Затем, используя результаты стандартизации (п. 3.1.3), рассчитали удельнуюсорбционную емкость на массу сухого сорбента. Результаты представлены в таблице16.Таблица 16 – Сорбционная емкость МХС Fe(III)Удельная сорбционная емкость,выраженная в:мкмоль/дм2мкмоль/мгПерваясерия0.000960.034Втораясерия0.000980.035Третьясерия0.000980.035Среднеезначение0.001 ± 0.0010.035 ± 0.001Удельная сорбционная емкость МХС Fe(III) по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSIсоставляетнеменее0.03мкмоль/мг,чтозначительнопревышаетемкостькоммерческого сорбента (до 0.0003 мкмоль/мг).3.4.5Определение сорбционной емкости МОС Fe(III)Определение сорбционной емкости МОС Fe(III) проводили по той же схеме, чтои в случае МХС: был использован фосфорилированный пептид с аминокислотнойпоследовательностью SSNGHV(pY)EKLSSI и молекулярной массой 1499 Да, которыйбыл взят с заведомым избытком (30 мкг на 1 мг МОС Fe(III)), чтобы добитьсянасыщения сорбента (п.
2.5.3). Количественный анализ пептида был проведен методомВЭЖХ-УФ (п. 2.7.2). По полученным данным рассчитывали удельную сорбционнуюемкость. Результаты представлены в таблице 17.Таблица 17 – Сорбционная емкость МОС Fe(III)Удельная сорбционная емкость,выраженная в:мкмоль/мгТакимобразом,Перваясерия0.0193сорбционнаяВтораясерия0.0195емкостьМОСТретьясерия0.0192Fe(III)Среднеезначение0.019 ± 0.001попептидуSSNGHV(pY)EKLSSI примерно в два раза ниже, чем у МХС Fe(III), но значительновыше емкости коммерческого сорбента.773.4.6Изучение специфичности сорбции пептидов, фосфорилированных поразличным аминокислотамИзвестно, что различные по аминокислотному составу пептиды могутсущественно отличаться по своим физико-химическим свойствам, что можетвыражаться, в том числе, в различной степени устойчивости связывания с сорбентами.В фосфорилированных пептидах остаток фосфорной кислоты может быть присоединенк трем аминокислотным остаткам: серина (S), треонина (T), тирозина (Y).
В связи сэтим, можно ожидать, что пептиды с разными сайтами фосфорилирования будутсвязыватьсяспредположенияизучаемымибылисорбентамивыбранынеодинаково.синтетическиеДляпроверкифосфорилированныеэтогопептидыSSNGHV(pY)EKLSSI (ранее исследованный при определении сорбционной емкостисорбентов)иFGE(pS)AGAAS,атакжеегонефосфорилированныйаналогFGESAGAAS. Все три пептида были взяты в равных количествах с заведомымизбытком, чтобы по их содержанию в проскоке оценить долю связавшихся с сорбентомпептидов.
Общее количество пептидов (60 мкг, по 20 мкг каждого) в 2 раза превышалонагрузку, выбранную при определении сорбционной емкости сорбентов, при том жеколичестве сорбентов (20 дм2 МХС Fe(III) и 1 мг МОС Fe(III)). Методика экспериментапредставлена в п. 2.5.3, количественный анализ проводили методом ВЭЖХ-МС (п.2.7.3). Усредненные результаты по трем повторениям представлены в таблице 18.Таблица 18 – Содержание связавшихся с сорбентом пептидовСорбция относительно начальной нагрузки, %МХС Fe(III)МОС Fe(III)SSNGHV(pY)EKLSSI67 ± 261 ± 2FGE(pS)AGAAS52 ± 270 ± 2FGESAGAAS9±112 ± 1ПептидКак и следовало ожидать, к МХС Fe(III) и МОС Fe(III) исследуемые пептидыимеют различную специфичность: на МХС Fe(III) количество сорбированногофосфорилированного по тирозину пептида выше, чем фосфорилированного по серину,а на МОС Fe(III) результат противоположный.
Как и следовало ожидать,нефосфорилированный пептид удерживается слабо в обоих случаях.783.4.7Термодинамические характеристики сорбции пептидовДля подтверждения выявленных закономерностей, был произведен расчетосновныхтермодинамическихSSNGHV(pY)EKLSSIифункцийFGE(pS)AGAASнапроцессаМХСсорбцииFe(III)иМОСпептидовFe(III).Экспериментально подход был аналогичен п.
3.4.3, методика представлена в п. 2.5.4.Изотермы представлены на рисунках 29 и 30; линеаризированные уравнения Ленгмюра– на рисунках 3 и 4 приложения; результаты представлены в таблицах 19-21 и втаблицах 3 и 4 приложения.АБРисунок 29 – Изотермы сорбции пептида SSNGHV(pY)EKLSSI при 19ºС, 29ºС и 39ºС:А – на МХС Fe(III), Б – на МОС Fe(III)АБРисунок 30 – Изотермы сорбции пептида FGE(pS)AGAAS при 19ºС, 29ºС и 39ºС:А – на МХС Fe(III), Б – на МОС Fe(III)79Таблица 19 – Значения концентраций и величины адсорбции пептидаSSNGHV(pY)EKLSSI до и после адсорбции на МХС Fe(III) и МОС Fe(III) приразличных температурахСорбентТемпература, ºС Cисх, мкг/мл Cв растворе, мкмоль/мл Г, мкмоль/г250.0190.023300.0390.02419350.0620.025400.0950.026000100.0010.012200.0030.023250.0090.029300.0190.032МХС Fe(III)29350.0480.032400.0760.034450.1100.034500.1400.034600.1520.036250.0150.039300.0350.04039350.0530.041400.0850.041200.0300.013250.0520.01519300.0770.015350.1170.016000100.0100.007200.0200.015250.0520.018МОС Fe(III)29300.0900.018350.1220.019400.1500.019450.1830.019500.1920.020200.0200.020250.0430.02139300.0750.022350.1050.02380Таблица 20 – Значения концентраций и величины адсорбции пептида FGE(pS)AGAASдо и после адсорбции на МХС Fe(III) и МОС Fe(III) при различных температурахСорбентТемпература, ºС Cисх, мкг/мл Cв растворе, мкмоль/мл Г, мкмоль/г200.0650.016250.0880.01619300.1120.017350.1620.017000100.0230.010200.0420.016250.0900.018300.1090.018МХС Fe(III)29350.1250.018400.1480.018450.1600.018500.1790.019600.2110.020200.0670.020250.0980.02039300.1320.021350.1720.021300.0270.023350.0480.02519400.0720.026450.0920.026000200.0120.019250.0190.026300.0240.031МОС Fe(III)29350.0410.033400.0610.033450.0900.034500.1170.036600.1290.038300.0280.037350.0480.03839400.0720.038450.0920.03981Таблица 21 – Значения величин К, ΔH0 и ΔS0 при проведении сорбции пептидов наМХС Fe(III) и МОС Fe(III) при 19ºС, 29ºС, 39ºССорбентПептидSSNGHV(pY)EKLSSIМХСFe(III)FGE(pS)AGAASSSNGHV(pY)EKLSSIМОСFe(III)FGE(pS)AGAASТермодинамическиесорбентовпорасчетыотношениюкТ, ºСК192939192939192939192939243505955114125135108158202197325442подтвердилипептидам,среднееΔH0,кДж/мольсреднееΔS0,Дж/моль·К-52 ± 251 ± 5-6 ± 140 ± 1-23 ± 442 ± 3-30 ± 647 ± 3выявленнуюфосфорилированнымспецифичностьпоразличнымаминокислотам.3.5 Фосфопротеомный анализ с использованием металл-аффиннойхроматографии3.5.1Оптимизация условий металл-аффинной хроматографииМетод металл-аффинной хроматографии позволяет в достаточно широкихпределах варьировать условия проведения анализа, исходя из природы аналита ипоследующих способов детектирования.
В случае фосфопротеомного подходаключевымпараметромуспешностиобогащенияявляетсястепеньизвлеченияфосфорилированных пептидов из многокомпонентной смеси. В качестве самогопростого модельного объекта для подбора условий десорбции аналитов с сорбентовбыл выбран уже использовавшийся синтетический фосфорилированный пептидSSNGHV(pY)EKLSSI.Известно, что элюировать аналит с металл-аффинного сорбента можнонесколькими способами: значительно изменить рН среды по сравнению с условиямисорбции, изменить донорную силу элюентов или применить раствор соли в высокой82концентрации. Поскольку элюирование простыми растворителями не обеспечиловысокую степень извлечения, было решено попробовать различные альтернативныеметоды десорбции, а именно:– замещениеаналитарастворителемродственнойструктуры(фосфорнаякислота);– добавка вещества, образующего очень устойчивые комплексы с железом(роданиднатрия,трилонБ),способноговытеснитьаналитзасчеткомплексообразования;– добавка вещества, которое может вытеснить аналит с сорбента за счет болеесильного связывания (перфтороктановая сульфокислота (ПФОС), перфторгексановаякислота).Длявыявленияоптимальныхусловийдесорбции,былпроведенрядэкспериментов по методике п.
2.6.1 с использованием пептида SSNGHV(pY)EKLSSI исорбента МХС Fe(III). Количественный анализ трех параллельных экспериментовпроводили методом ВЭЖХ-УФ (п. 2.7.2), результаты представлены в таблице 22.Таблица 22 – Степени извлечения пептида SSNGHV(pY)EKLSSI с МХС Fe(III)различными элюентамиЭлюентСтепень извлечения, %0.4M NH4OH40 ± 115% ПФОС в 0.4M NH4OH59 ± 35% NaSCN в 0.4M NH4OH45 ± 210% трилон Б в 0.4M NH4OH44 ± 30.5% H3PO444 ± 20.5% пиперидин63 ± 315% ПФОС в 0.5% пиперидине86 ± 310% н-C6F12COOH в 0.5% пиперидине10 ± 10.05% SDS в 0.5% пиперидине13 ± 20.0005% H3PO4 в 0.5% пиперидине12 ± 2Высшая степень извлечения (86 %) была достигнута при использовании вкачестве элюента 15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина. Здесь и далеезапись «15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина» означает 15%-е содержаниераствора перфтороктановой сульфокислоты в метаноле (концентрация 1 мг/мл) в 0.5%водном растворе пиперидина.
Молекула ПФОС содержит большое количество атомов83фтора, а также богатую атомами кислорода сульфогруппу, имеющих высокое сродствок атомам железа по принципу Пирсона, что, по-видимому, способствует вытеснениюпептида с сорбента за счет более прочного связывания кислоты с сорбентом. Прииспользовании 0.5% водного раствора пиперидина без добавок удалось достигнутьстепени извлечения лишь 63 %.Таким образом, по результатам исследования для увеличения степениизвлеченияфосфорилированныхпептидовбылапредложенаметодикапоследовательного элюирования 0.4 М водным раствором аммиака, 0.5% воднымраствором пиперидина и, затем, 15% раствором ПФОС в 0.5% водном растворепиперидина, то есть тремя элюентами, обеспечивающими различные механизмыдесорбции аналита с сорбента.3.5.2Изучение специфичности сорбции на примере смеси различныхфосфорилированных пептидовСледующим шагом стало исследование смеси пептидов (нефосфорилированныхи фосфорилированных по разным аминокислотам), а именно: смесь 8 пептидовфрагментов тау-белка, пептиды SSNGHV(pY)EKLSSI, FGE(pS)AGAAS и FGESAGAAS(таблица 23).Таблица 23 – Набор синтетических пептидов№Аминокислотная последовательность пептида1SRTPSLPTPPTREPK1pSRpTPSLPTPPTREPK7.071743.8791ppSRpTPpSLPTPPTREPK5.051823.8462VAVVRTPPKSPSSAK11.17 1523.8912pVAVVRpTPPKSPSSAK8.671603.8572ppVAVVRpTPPKpSPSSAK6.981683.8243TDHGAEIVYKSPVVSGDTSPR5.352215.1003ppTDHGAEIVYKpSPVVSGDTpSPR4.032375.0324FGESAGAAS4.00796.3454pFGEpSAGAAS3.30876.3145pSSNGHVpYEKLSSI7.821500.673pI[M+H]+10.83 1663.91384Для проведения металл-аффинной хроматографии все пептиды были взяты вравныхколичествах(п.2.6.2).Количественныйанализтрехпараллельныхэкспериментов проводили методом ВЭЖХ-МС (п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
