Диссертация (1150378), страница 14

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 14)

Основа металл-аффинной хроматографии – донорноакцепторное взаимодействие между металлом сорбента и кислородамифосфорной группы, поэтому в качестве элюентов были выбраны: 0,5% водныйпиперидин, показавший свою эффективность для железосодержащегосорбента (PHOS-Select™ Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich)); 0,5% имидазол(ранее нами не применяемый); водный раствор ацетонитрила (30%, 50%, 70%),десорбирующий фосфонилированные пептиды [107]. Контроль десорбциипроводили методом МАЛДИ-МС. Эксперимент показал, что водные растворыпиперидина, имидазола и 30% водный раствор ацетонитрила не элюируютаддукты с сорбента, в то время, как в масс-спектрах, соответствующихэлюатам 50% и 70% водного ацетонитрила, присутствуют искомые сигналы,но недостаточной интенсивности по отношению к сигналам неспецифичносорбированных пептидов (рис.

31). Стоит отметить, что использование вкачестве элюента смеси 0,5% пиперидина в 70% ацетонитриле не улучшаетэлюированиеаддуктовссорбента.Образецэлюата70%воднымацетонитрилом был передан для количественного анализа (НИИ ГПЭЧ ФМБАРоссии), который показал, что при однократной обработке с сорбентаэлюируются примерно 25% сорбированных аддуктов, что потребовалооптимизации методики элюирования.91Рисунок 31. МАЛДИ масс-спектр образца, содержащего пептическийгидролизатсывороточногоальбуминачеловека,модифицированногозоманом: 1 – масс-спектр гидролизата до проведения металл-аффиннойхроматографии; 2 – проскок с колонки; 3 – элюат с колонки 70% воднымацетонирилом.3.15.3 ИсследованиевозможностидесорбцииаддуктовФОСссывороточным альбумином человека с сорбента путем разрушения структурымонослоевПри исследовании монослоев стеарата лантана было показано, чтонеполярные растворители (гексан) способны их полностью растворить.

Намибыло сделано предположение, что такая процедура способна привести кулучшению десорбции аддуктов. Во-первых, нарушение структуры монослоядолжно снизить силу взаимодействия между аналитом и ионами металлов, вовторых – выделение пептидов в этом случае можно провести по принципужидкость-жидкостной экстракции.92Сорбцию аддуктов из пептического гидролизата сывороточногоальбумина человека, модифицированного зоманом, проводили в условиях,описанных выше (методика представлена в п.

1.3.1). После промывки сорбентоставили на воздухе для испарения остатков воды, после чего в спиновуюколонку добавили гексан до полного растворения монослоев (методикапредставлена в п. 1.3.2). Затем к раствору добавили 100 мкл воды и надежнозакрытую колонку энергично встряхивали в течение 1 минуты дляперемешиваниядвухфазовойсистемы(методжидкость-жидкостнойэкстракции). После чего открытую колонку оставили до полного испарениягексана и перехода стеарата лантана в твердое состояние, что позволиловодную фазу отделить с помощью центрифугирования. Затем, образец былпроанализирован методом МАЛДИ-МС (рис.

32).Рисунок 32. МАЛДИ масс-спектр образца, содержащего пептическийгидролизатсывороточногоальбуминачеловека,модифицированногозоманом: 1 – масс-спектр гидролизата до проведения металл-аффиннойхроматографии; 2 – проскок с колонки; 3 – водная фракция после разрушениясорбента; 4 – фракция ацетонитрила после разрушения сорбента.93Было показано, что в водной фазе действительно содержатся искомыеаддукты, (пептид VRYGDTKKVPQVS, пептид LVRYGDTKKVPQVS). Послечего перерастворенный сорбент обработали 70% водным растворомацетонитрила. МАЛДИ-МС анализ элюата показал, что такая обработкапозволяет значительно улучшить извлечение аддуктов из образца.3.15.4Оптимизация методики металл-аффинной хроматографииПри использовании 70% водного ацетонитрила в качестве элюента намибыло показано, что элюирование проходит с эффективностью 25%.

Былосделано предположение, что добавка кислоты к такому элюенту можетулучшить эффективность. Предыдущие эксперименты показали, что такиесильные донорные соединения, как пиперидин и имидазол, не позволяютэффективно элюировать аддукты ФОВ с сывороточным альбумином человекас монослоев стеарата лантана. Причиной этого, возможно, являетсянедостаточность их донорной силы. Известно, что сильные кислоты Льюиса,к которым относится лантан, кроме кислорода, входящего в состав фосфорнойгруппы, имеют высокое сродство к атомам фтора. Поэтому в качестведесорбирующего агента было выбрано соединение, имеющие в своем составекак атомы кислорода (входящие в состав сульфогруппы), так и значительноеколичество атомов фтора, а именно перфтороктановая сульфокислота(ПФОСК) (рис.

33). Такое строение молекулы позволило предположить, чтодобавление ПФОСК к элюенту, уже показавшему свою эффективность,позволит улучшить десорбцию аддуктов с сорбента. Кроме того, мы сделалипредположение, что добавление ПФОСК к пиперидину также должноповлиять на эффективность элюирования аддуктов с сорбента.94Рисунок 33. Структурная формула перфтороктансульфоновой кислоты.Соответственно, было предложено три схемы элюирования дляулучшения десорбции аддуктов с сорбента (рис. 34). Поскольку была показанаэффективность разрушения сорбента для десорбции аддуктов, то послепроведения элюирования в соответствии со схемой, была добавлена стадияразрушения сорбента, чтобы проконтролировать полноту десорбции.Рисунок 34. Схема оптимизации десорбции аддуктов зомана ссывороточным альбумином человека с монослоев стеарата лантана.Результаты оптимизации методики по этой схеме представлены нарисунке 35.

Сигналы, соответствующие аддуктам, были найдены в массспектрах всех трех фракций. При этом, добавка перфтороктансульфоновой95кислоты к элюенту заметно улучшает элюирование, а перерастворениесорбента позволяет десорбировать дополнительное количество искомыхфосфонилированных пептидов.В случае реализации схемы II результаты очень близки к первомуэксперименту (рис. 36).

Точно также в масс-спектрах всех трех фракций былиобнаружены сигналы аддуктов, но, в отличие от схемы I, добавка ТФУ кэлюенту не приводит к значительному улучшению элюирования аддуктов ссорбента.Лучший результат был получен при обработке сорбента растворомпиперидина с добавкой ПФОСК (схема III). Для этого элюата были полученысамые интенсивные масс-спектры (рис. 37). Кроме того, после перестворениясорбента в гексане сигналы в масс-спектрах, соответствующие аддуктам,практически отсутствовали.Рисунок 35. Масс-спектры элюатов с монослоев стеарата лантана,полученных по схеме I: 1 - 70% водный ацетонитрил, 2 - 70% водныйацетонитрил в 0,1%ТФУ, 3 – 70% водный ацетонитрил в 0,1%ТФУ послеперерастворения сорбента в гексане.96Рисунок 36 – Масс-спектры элюатов с монослоев стеарата лантана,полученных по схеме II: 1 - 70% водный ацетонитрил 0.015% добавкойПФОСК, 2 - 70% водный ацетонитрил с 0.015% добавкой ПФОСК в 0,1%ТФУ,3 – 70% водный ацетонитрил с 0.015% добавкой ПФОСК в 0,1%ТФУ послеперерастворения сорбента в гексанеРисунок 37 – Масс-спектры элюатов с монослоев стеарата лантана,полученных по схеме III: 1 – 0,5% водный пиперидин с 0.015% добавкойПФОСК, 2 – 70% водный ацетонитрил с 0.015% добавкой ПФОСК в 0,1% ТФУпосле перерастворения сорбента в гексане97Все результаты по отработке и оптимизации по отработке иоптимизации десорбции сведены в таблицу 5.Таблица 5.

Эффективность элюентов, используемых для проведенияметалл-аффинного анализа на монослоях стеарата лантанаЭлюент (способМассы пептидов, m/zдесорбции)пептического гидролизатоальбумина человека,модифицированного зоманом1567,91680,92% аммиак--0,5% имидазол--0,5% пиперидин--70%: ацетонитрил--70%: ацетонитрил с++++++++ПФОСК70%: ацетонитрил сПФОСК в 0,1% ТФУРазрушение сорбентагексаном с последующейобработкой 70%: ацетонитриломРазрушение сорбентагексаном с последующейобработкой 70%: ацетонитриломс ПФОСК и 0,1% ТФУ983.15.5ПослеМеталл-аффинная хроматография на МАЛДИ мишенипроведениясорбцииобразца,содержащегопептидысывороточного альбумина человека, модифицированного зоманом, частьсорбента извлекли из спиновой колонки при помощи шпателя вместе сматрицей CHCA и нанесли на мишень для МАЛДИ-МС анализа, затем снялисоответствующийспектр,накоторомбылинайденысигналы,соответствующие искомым аддуктам (рис.

38). Это позволяет проводитьидентификацию аддуктов без проведения десорбции, сокращает время иколичество реактивов необходимые для пробоподготовки.Рисунок 38. МАЛДИ-масс-спектр монослоев стеарата лантана послепроведениясорбцииобразца,содержащегопептическийгидролизатсывороточного альбумина человека, модифицированного зоманомДалее было решено провести металл-аффинную хроматографиюнепосредственно на МАЛДИ-мишени. Небольшую часть коллапсированныхмонослоев стеарата лантана нанесли на мишень, на сорбент наносили 2 мкл99пептическогогидролизатасывороточногоальбуминачеловека,модифицированного зоманом (1 мг/мл в пересчете на белок) и 2 мкл 2%водного раствора аммиака, 30 с пипетировали и оставили на 10 минут.

Дляоценки проскока, жидкую фракцию собирали и наносили в другую ячейкумишени для дальнейшего анализа. К сорбенту добавили 2 мкл 2% аммиака дляпромывки, пипетировали, фракцию удаляли. Для проведения десорбции ксорбенту добавили 2 мкл водного раствора пиперидина с 0,015% ПФОСК,пипетировали и добавляли 1,5 мкл раствора матрицы CHCA. МАЛДИ-массспектрометрический анализ показал, что сигналы, соответствующие аддуктам,отсутствуют в проскоке (рис.

Характеристики

Список файлов диссертации