Диссертация (1150378), страница 15
Текст из файла (страница 15)
39, 1) и надежно детектируются в элюате (рис.39, 2), что было подтверждено при проведении анализа методом тандемноймасс-спектроскопии (рис. 40).Рисунок 39. МАЛДИ-масс-спектры после проведения сорбции образца,содержащего пептический гидролизат сывороточного альбумина человека,модифицированного зоманом на монослоях стеарата лантана, нанесенных намишень: 1 – проскок, 2 – элюат 0,5% водным пиперидином с 0,015% ПФОСК.100Рисунок 40. Идентификация фосфонилированных пепидов в элюатепосле проведения металл-аффинного анализа на мишени: 1 – пептидVRYGDTKKVPQVS; 2 – пептид LVRYGDTKKVPQVSТаким образом, с применением разработанного металл-аффинногосорбента был успешно проведен анализ образца, содержащего пептическийгидролизатсывороточногозоманом,непосредственноальбуминанаспектрометрического анализа.101человека,мишенимодифицированногодляМАЛДИ-масс-3.16 Исследование возможности выделения методом металл-аффиннойхроматографии аддуктов холинэстеразы с ФОВ3.16.1 Исследование сорбции и десорбции бутирилхолинэстеразылошади, модифицированной RVx, методом атомно-силовой микроскопииКакбылопоказанонапредыдущейстадииэкспериментасиспользованием метода АСМ (п.
2.3.3), сорбция и десорбция бычьего казеинапри использовании в качестве сорбента монослоев стеарата лантана проходитвусловияхклассическойбутирилхолинэстераза,металл-аффинноймодифицированнаяхроматографии.ФОВ,посвоейОднако,структуреотличается от казеина: во-первых, казеин имеет в своем составе значительноеколичество остатков фосфорной кислоты, в то время как информации офосфорилировании бутирилхолинэстеразы нет, только в случае модификацииостатком ФОВ появляется сайт фосфонилирования; во-вторых, в глобулахказеина фосфорные группы находятся на поверхности, а активный центрбутирилхолинэстеразы – в центре молекулы (в кармане). Поэтому,представлялось немаловажным исследовать возможность взаимодействияполноразмерной бутирилхолинэстеразы с сорбентом.
Для исследования вкачестве контроля использовали образец, содержащий бутирилхолинэстеразулошади в нативной форме. Эксперимент провели по методике, описанной в п.2.3.3, результаты представлены на рисунке 41, а, б. На микрофотографияхпоказано, что в условиях классической металл-аффинной хроматографиибутирилхолинэстераза успешно сорбируется и десорбируется с монослоевстеарата лантана.
По всей видимости, в данном случае взаимодействие белкас металлом сорбента проходит через многочисленные кислороды серинов итирозинов, содержащихся в молекуле белка. При использовании в качествеобразца бутирилхолинэстеразы, модифицированной остатком RVx, десорбцияв растворе аммиака не происходит (рис.
41, в, г). Особенно наглядно этопоказано в эксперименте с разрушением крупных агломератов белка путеминкубирования образца в додецилсульфате натрия/SDS (рис. 41, д, е).102Микрофотографии до десорбции и после практически идентичны. Наосновании проведенного эксперимента можно сделать вывод, что монослоистеарата лантана могут быть использованы для выделения полноразмернойбутирилхолинэстеразы из биологических образцов различной природы.3.16.2 Исследование возможности выделения аддуктов холинэстеразы сзоманом методом металл-аффинной хроматографии на монослоях стеараталантанаИсследование возможности выделения методом металл-аффиннойхроматографии аддуктов холинэстераз с ФОВ проводили на примеретриптическогогидролизатабутирилхолинэстеразылошади,модифицированной зоманом, с помощью разработанного сорбента на основестеарата лантана.
Выбор объекта исследования был обусловлен тем, чтононапептидбутирилхолинэстеразычеловека,содержащийсайтфосфонилирования и образующийся в процессе пепсинолиза не дает сигналапри анализе методом МАЛДИ-МС, а триптический пептид – имеет слишкомбольшую массу.В то же время, триптический пептид бутирилхолинэстеразы лошади,содержащий серин-198, способный присоединять остаток зомана, имеет МН+2199.17 Да, что делает его удобным объектом исследования.103Рисунок 41. Исследование взаимодействия бутирилхолинэстеразылошадисмонослоямистеараталантанаметодомАСМ:а,б–бутирилхолинэстераза лошади (50х50мкм), в, г – бутирилхолинэстеразалошади, модифицированная RVx (50х50мкм), д, е – бутирилхолинэстеразалошади, модифицированная RVx после инкубирования в 1% SDS (20х20 мкм).Слева – после сорбции в 0,1% ТФУ, справа – после десорбции в 5% аммиаке.104Полученный из НИИ ГПЭЧ ФМБА России образец триптическогогидролизата бутирилхолинэстеразы лошади был проанализирован методомМАЛДИ-МС для поиска и идентификации аддуктов белка с зоманом.
Стоитотметить, что концентрация бутирилхолинэстеразы составляла 0,1 мг/мл впересчете на белок, что в 10 раз ниже, чем концентрация белка вэкспериментахссывороточнымальбуминомчеловека.Результатыпредставлены на рисунке 42. Как показано на рисунке, в масс-спектренаблюдаютсясигналысоответствующие:1–нативномупептиду,содержащему серин-198 SVTLFGESAGAASVSLHLLSPR; 2 – пептиду,содержащему остаток зомана и имеющему разницу в массах с нативным в 162ДаSVTLFGESHPinacolylMPAAGAASVSLHLLSPR,где"PinacolylMPA"соответствует обозначению "GD"; 3 – пептиду, содержащему остатокметилфосфоновой кислоты (продукт старения остатка зомана) и имеющемуразницу в массах с нативным в 78 Да SVTLFGESMPAAGAASVSLHLLSPR.Рисунок 42. Фрагмент МАЛДИ масс-спектра, содержащий сигналы аддуктовбутирилхолинэстеразцы лошади с зоманом и метилфосфоновой кислотой.105Рисунок 43.
Идентификация аддуктов бутирилхолинэстеразцы лошади сзоманом и метилфосфоновой кислотой:1 – пептид SVTLFGESHPinacolylMPAAGAASVSLHLLSPR;2 – пептид SVTLFGESMPAAGAASVSLHLLSPR.Для идентификации аддуктов был проведен МАЛДИ-МС-МС анализ.По отщеплению нейтральной частицы зомана (пинаколил) с получениемсостарившейсяформыаддуктабылополностьюдоказаноналичиесоответствующих модификаций у пептидов (рис. 43).Так как в масс-спектре были обнаружены сигналы, соответствующие каксостарившейся, так и несостарившейся формам аддуктов, было сделанопредположение, что пептид, модифицированный остатком метилфосфоновойкислоты,можетпроявлятьсвойства,подобныефосфорилированнымпептидам. Поэтому была добавлена стадия элюирования 0,5% воднымпиперидиномацетонитриломилишьсзатем0,1%ТФУ.сорбентПослеобрабатывалипроведения70%воднымметалл-аффиннойхроматографии элюаты анализировали методом МАЛДИ-МС, результатыпредставлены на рисунке 44.106Эксперимент полностью подтвердил предположение о схожестивзаимодействия сорбента с аддуктом с MPA и с фосфорилированнымипептидами.Рисунок 44.
МАЛДИ-масс-спектры элюатов с монослоев стеараталантанатриптическогогидролизатабутирилхолинэстеразылошади,модифицированной зоманом (А – выделенная область, соответствующаясигналамаддуктовSVTLFGESHPinacolylMPAAGAASVSLHLLSPRиSVTLFGESMPAAGAASVSLHLLSPR): 1 – проскок с колонки; 2 – 0,5% водныйпиперидин; 3 – 70% водный ацетонитрил с 0,1% ТФУ.3.16.3 Сравнение специфичных свойств монослоев стеарата лантана скоммерчески доступными металл-аффинными сорбентамиИзвестно, что коммерческие металл-аффинные сорбенты, такие какTitansphere Phos-TiO, Supel-Tips Ti (Supelco) и т.д.
имеют специфичность какк фосфорилированным, так и к фосфонилированным пептидам. В случаесорбента, разработанного в ходе данной работы, ярко выражено наличие болеевысокого уровня специфичности к несостарившимся аддуктам белков крови сФОВ, по сравнению с аддуктами с MPA и фосфонилированными пептидами.107Основные результаты1. Получены и охарактеризованы мономолекулярные пленки на основестеарата лантана. Показана возможность их использования в качестве сорбентов,как перенесенных методом погружения пластины монослоев на основе стеараталантана, так и коллапсированных монослоев.2.
Золь-гельметодомсприменениеммикроволновогоизлучениясинтезирован дисперсный хромит лантана. Определена структура агрегатов,размер частиц. Показана применимость в качестве металл-аффинного сорбента.3. Изучена структура поверхности хромита лантана и коллапсированныхмонослоев на основе стеарата лантана методами сканирующей электронноймикроскопии. Определена удельная поверхность сорбентов: 15,5 м2/г для хромиталантана, 14 м2/г для коллапсированных монослоёв на основе стеарата лантана.Характеристики сорбента коллапсированных монослоёв на основе стеараталантана приведены в приложении.4. Оптимизированы условия сорбции и десорбции фосфорилированныхпептидов коллапсированными монослоями на основе стеарата лантана.5. Определена сорбционная ёмкость коллапсированных монослоев наоснове стеарата лантана по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSI (20 мкг/мг).6.
Доказана пригодность коллапсированных монослоев на основе стеараталантана для использования в качестве селективного металл-аффинного сорбентадляфосфорилированныхфосфорилированныхипептидов.Показанафосфонилированныхвозможностьпептидовизвыделенияпептическогогидролизата альбумина человека.7. Доказана возможность селективного выделения аддуктов зомана спептидами сывороточного альбумина человека на коллапсированных монослояхна основе стеарата лантана.8. Доказанавозможностьвыделенияаддуктовполноразмернойбутирилхолинэстеразы с RVx на коллапсированных монослоях на основе стеараталантана.108Список сокращенийАСМ – атомно-силовая микроскопия,АХЭ – ацетилхолинэстераза,БЭТ – теория Брюнера-Эммета-Теллера,ВЭЖХ-УФ–высокоэффективнаяжидкостная хроматография сультрафиолетовым детектированием,ДЛФО – теория Дерягина, Ландау, Фервея, ОвербекаМАЛДИ – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация,МС – масс-спектроскопия,НИИ ГПЭЧ ФМБА – Научно-исследовательский институт гигиены,профпатологии и экологии человека федерального медико-биологическогоагентства.ПАВ – поверхностно-активное вещество,ПЛБ – пленки Ленгмюра-Блоджетт,ПФОС – перфтороктановая сульфокислота,СЭМ – сканирующая электронная микроскопия,ТНЗ – точка нулевого заряда,ТФУ – трифторуксусная кислота,ФОВ – фосфорорганические вещества.109ПриложениеХарактеристики сорбента на основе коллапсированных монослоевстеарата лантанаОписание продуктаВнешний вид: белая творожистая массаУдельная масса: 0.029 ± 0.003 г/дм2Изоэлектрическая точка: 3,3 ед.
рНУдельная поверхность 14 м2/гХимический составОсновное структурное звено: La(C17H35COO)2+Условия храненияПод слоем воды при температуре от +40С до +300ССорбционная емкость20 мкг/мг по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSIСпецифичное вз-е с дафосфонилированнымипептидамиХимическаяводадаустойчивость0,1 % трифторуксусная кислотада0,1 % муравьиная кислотада2 % уксусная кислотада5 % аммиакда0,5 % пиперидинда0,5 % триэтиламинда70 % ацетонитрил (менее 3 минут)да/нет100 % ацетонитрилнет100 % метанол (менее 3 минут)да100 % этанол (менее 3 минут)да100 % изопропанолда0,015% ПФОСК в 0,5% пиперидинедатетрахлорметаннетгексан (и другие предельные растворители)нетминеральные кислотынет110Список литературы1. Sabik, L.M.E, Abbas, R.A, Ismail, M.M, El-Refaei, S.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
