Диссертация (1150378), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Исходный образец и проскок анализировали методомМАЛДИ-МС. Как показано на рисунке 25, очень интенсивный сигнал 1568 Дадля фосфорилированного пептида VRYGDTKKVPQVST, присутствующий вмасс-спектре исходного образца и соответствующий сигналу аддукта (рис. 26,1), отсутствует в масс-спектре проскока (рис. 26, 2), сигнал 1652.8 Дафосфорилированного пептида LVRYTKKVPQVST присутствует, но имеетзначительно меньшую интенсивность, что свидетельствует о наличииспецифичного взаимодействия пептидов, модифицированных зоманом слантаном.83Рисунокгидролизат26.Масс-спектрысывороточногообразца,альбуминасодержащегочеловека,пептическиймодифицированногозоманом: 1 (снизу) – исходный образец; 2 (сверху) – проскок с сорбента.3.13.
ИсследованиесорбцииаддуктовФОВссывороточнымальбумином человека на хромите лантанаВ случае хромита лантана также был проведен эксперимент для сорбцииаддуктов ФОВ с белками. Так же, как и в случае стеарата лантана, экспериментпроводился с пептическим гидролизатом сывороточного альбумина человека,модифицированного зоманом. Одно и то же определяемое вещество в разныхэкспериментах позволяет сравнивать металл-хелатный сорбент на основеколлапсированных пленок стеарата лантана и металл-оксидный сорбент –хромит лантана.Гидролизат, как и в пункте 3.12, получен из белка, инкубированного сзоманом высокой концентрации 0,1 мг/мл (образец был получен от НИИГПЭЧ ФМБА России). Исходный образец и проскок анализировали методомМАЛДИ-МС.Какпоказанонарисунке27,интенсивныесигналы,присутствующие в масс-спектре исходного образца и соответствующие84сигналам аддуктов (рис.
27, 1), отсутствуют в масс-спектре проскока илипроявлены слабо (рис. 27, 2), что свидетельствует о наличии специфичноговзаимодействия пептидов, модифицированных зоманом с лантаном. Вспектрах после десорбции (рис. 27, 3-5) пики аддуктов снова обнаруживаются.Рисунок 27. Масс-спектры образца, содержащего пептический гидролизатсывороточного альбумина человека, модифицированного зоманом: 1 –исходный образец; 2 – проскок с сорбента; 3,4,5 – последовательная промывкаводным раствором аммиака, 50% раствором ацетонитрила в воде, раствором,содержащим 50% ацетонитрила и 0,1% ТФУ.853.14. Обоснование выбора сорбента для дальнейших исследованийВ литературе описано большое количество сорбентов для протеомногообогащения и анализа с иммобилизованными ионами металлов.
В качествеконкурентов предлагаются как металл-оксидные, так и металл-хелатныесорбенты. Каждый из этих подходов имеет свои плюсы и минусы, так металлхелатныесорбентыотличаютсябольшейселективностьюипредсказуемостью, в то время как металл-оксидные сорбенты менееподвержены воздействию агрессивных сред, света, тряски и зачастую прощесинтезируются. Коммерческие сорбенты, представленные на рынке, обычноиспользуют ионы титана и циркония. При этом показано, что ионы цирконияимеют низкое сродство к монофосфорилированным пептидам, а ионы титанамогут необратимо сорбировать белки.
Работы, в которых ионы лантанаиспользуются в металл-аффинной сорбции начали появляться в литературесравнительно недавно. Потому представляется перспективным исследованиесорбентов для жестких оснований на основе жесткой кислоты – иона лантана(III). Причем, интерес представляют и синтез оксидных сорбентов с ионамилантана, и создание металл-хелатных соединений.На основе экспериментов, проведенных в процессе охарактеризациисорбентов, можно сделать вывод, что каждый из разработанных сорбентовимеет свои преимущества:Для пленочного стеарата лантана можно отметить следующеиепреимущества:1.Простотаметодаполучениямонослоевстеараталантана,позволяющая получать сорбент непосредственно в лаборатории передпроведением металл-аффинного анализа.2.Дешевизна реактивов, необходимых для получения сорбента.3.Отсутствие побочных продуктов при получении монослоёв.864.Емкость сорбента на основе монослоев стеарата лантана,составляет 20мкг/15мг (по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSI), что на 32% больше,чем заявлено у коммерческого Titansphere Phos-TiO (50мкг/50мг).Для хромита лантана можно назвать следующие преимущества:1.Большая удельная поверхность, по сравнению с пленочнымстеаратом лантана.2.Возможность проведения реакции в бытовой микроволновойпечке.Однако, каждый из сорбентов не лишен и минусов.
Недостаткомпленочного стеарата лантана в качестве сорбента является низкий уровеньвзаимодействия с фосфорилированными пептидами при низкой концентрациипептидов в образце, хотя взаимодействие с фосфонилированными пептидамипроходит успешно. К минусам хромита лантана можно отнести сложнуюформу агрегатов и невозможность получения дисперсии, состоящей изотдельных наночастиц. Кроме того, влияние хрома на металл-аффиннуюсорбцию описано слабо и требует отдельного исследования. В результатесравнения, в качестве металл-аффинного сорбента для фосфопротеомногоанализа был выбран пленочный стеарат лантана.3.15 Выделение аддуктов сывороточного альбумина человека с ФОВметодом металл-аффинной хроматографии на монослоях стеарата лантана(определение условий сорбции-десорбции)3.15.1 Определение условий сорбции фосфонилированных пептидов изпептическогогидролизатасыворочногоальбуминачеловека,модифицированного зоманом, на монослоях стеарата лантанаРанее было показано, что фосфонилированные пептиды следуетсорбировать из водного раствора со значением рН>8, так как это препятствуетнеспецифичной сорбции многих пептидов, в том числе фосфорилированных,увеличивает количество сорбированных фосфонилированных пептидов, что87приводит к повышению эффективности металл-аффинной экстракции именнофосфонилированных пептидов [107].
Поэтому сорбцию проводили вприсутствии водного раствора аммиака. Для проведения эксперимента былвыбранпептическийгидролизатсывороточногоальбуминачеловека,модифицированного зоманом (начальная концентрация белка – 1 мг/мл) свысоким содержанием аддуктов в образце (образец предоставлен НИИГПЭЧФМБА России, концентрация зомана при проведении модификации 0,1 мг/мл).МАЛДИ-МСанализпоказалнадежнуюидентификациюдвухфосфонилированных пептидов: VRYGDTKKVPQVS с МН+ 1567,8 Да иLVRYGDTKKVPQVS с МН+ 1680.9 Да. Идентификацию пептидов проводилипо отщеплению нейтральной частицы, соответствующей остатку зомана (рис.28, 29).Рисунок 28.
МАЛДИ масс-спектр образца, содержащего пептическийгидролизатсывороточногоальбуминазоманом.88человека,модифицированногоРисунок29.идентификацияфосфонилированныхпепидовпоотщеплению нейтральной частицы: 1 – пептид VRYGDTKKVPQVS; 2 – пептидLVRYGDTKKVPQVSДалее были приготовлены две спиновые колонки, содержащие 50 дм2(15мг) сорбента на основе монослоев стеарата лантана. В одну колонку былодобавлено 25 мкл гидролизата сывороточного альбумина человека с 75 мкл 2%водного раствора аммиака, во вторую – 50 мкл гидролизата с 50 мкл 2%водного раствора аммиака. После проведения сорбции проскок с колонкианализировали методом МАЛДИ-МС.
Как показано на рисунке 30, в первомпроскоке ни одного из фосфонилированных пептидов обнаружено не было, вто время как в проскоке со второй колонки наблюдается сигнал,соответствующий пептиду LVRYGDTKKVPQVS МН+ 1567,8 Да.Таким образом, было показано, что для проведения эффективнойсорбции и во избежание перегрузки сорбента, количество образца не должнопревышать 25 мкг в пересчете на начальную концентрацию белка на 50 дм 2(15мг) сорбента.89Рисунок 30 – МАЛДИ масс-спектр образца, содержащего пептическийгидролизатсывороточногоальбуминачеловека,модифицированногозоманом: 1 – гидролизат до проведения металл-аффинной хроматографии; 2 –проскок с колонки с нагрузкой 25 мкл гидролизата на 15 мг сорбента; 3 –проскок с колонки с нагрузкой 50 мкл гидролизата на 15 мг сорбента3.15.2Определение условий десорбции фосфонилированныхпептидов сыворочного альбумина человека, модифицированного зоманом, смонослоев стеарата лантанаКлассическая металл-аффинная хроматография, применяемая дляобогащения образцов пептидами предполагает в качестве десорбирующегоагента (элюента) использование водного раствора аммиака.
Но ранее былопоказано, что в этих условиях аддукты ФОВ с белками крови недесорбируются с металл-аффинных сорбентах (сорбенты, содержащие железо(III), титан (IV), цирконий (IV)). Тем более, что в ходе этой работы уже былопоказано, что фосфонилированные пептиды эффективно сорбируются на90монослоях стеарата лантана в присутствии аммиака. Следовательно, былонеобходимо подобрать элюент, в котором будут разрушаться связи междусорбентом и аналитом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
